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流式细胞术培训PPT.ppt
(2)DNA含量检测
高精确性—以及极小的 仪器误差(CV)!
BD FASCalibur
• 质量控制:
变异系数(CV):流式细胞仪的“分辨率”。
Tip:获取高质量数据的关键在于获得小的CV值。
(3)用流式细胞仪发现的侧群细胞(SP Cell)
(4)染色体核型
Hoechst 33258 AT
2
1
细胞膜:表面糖分子、细 胞膜流动性和通透性、膜 融合和翻转、膜脂质构成、 细胞膜及线粒体膜电位 等。
、
细胞质:(1)Ca2+、 Na+、K+、H+ (2)信 号网络蛋白、各种抗 原、各类酶分子、细 胞骨架蛋白、荧光蛋 白(3)酶活、蛋白磷 酸化、乙酰化、甲基 化修饰等
无需染色:大小,颗粒度,自发荧光,色素,绝对计数等
(2)测量对象:颗粒尺度
(单细胞悬浮液)
当前流式细胞仪可测量颗粒大小 最小约0.2μm
电镜
光学 显微镜
人眼极限
0.1nm 1nm 10nm
100nm
1μm
10μm
100μm
1mm
原子氨基蛋白 病毒 支原体 细菌 酸质
红细胞 上皮细胞 植物细胞
(3)可测量的细胞参数
核酸分析: DNA、 RNA含量,DNA合 成、降解、断裂, 区分核酸单、双 链,测量端粒长 度、染色质结 构 、碱基构成。 染色单体分选。
• 经验性总结:细胞内几乎所有能够被荧 光染料标记的成分或某种变化都可以用 流式细胞仪进行检测。
流式细胞仪原理简要
一.流体动力学聚焦
流动室
流体动力学聚焦
流速:10m/s 最大40m/s——高通量 20,000—200,000 cell/S
激光聚焦
流体动力学聚焦的效果是,位于液流轴线上的细胞 被依次排列成一条单细胞的队列,沿着一条极为精 确而稳定的轨道运动。
(5)各色荧光信号分离
激光束
侧向散射光, 荧光
细胞
二色反光镜
1
2
3
前向 散射 光
收集透镜
带通滤光片 光电倍增管
多通道(多参数)
另一个参数:时间—连续 过程的检测
多激光激发:多通道(多参数)—6杆激光,17个荧光通道
(6)更先进的光信号收集和分离方式
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ八角反射式 信号收集系统
提高的灵敏度— (二色反光镜)反射~透 射:95%~80%
流式细胞术的功能特点与应用
(3)流式细胞仪的功能特点
多通道(多参数) 高通量 高灵敏度 定量 高精确度 细胞分选
二.流式细胞术的应用
(1) 几个著名的实际应用: ◇ HIV感染与病程动态监测:辅助T淋巴细胞的绝对计数; ◇ 癌症动态及治疗方案:细胞DNA含量和增殖活性; ◇ 器官移植: ◇ 动物育种的性别选择:分选含x或y染色体的精子; ◇ 人类体外受精; ◇ 造血干细胞和其他一大类干细胞各个分化层次鉴别; ◇ 海洋、环境微生物研究,发现未知种属。
二.荧光检测
(1)空间立体激发结构
三轴垂直:高 精确度—2%的 荧光差别
探测光路聚焦
(2)散射光信号的产生
前向散射光:大小 侧向散射光:颗粒度
(3)PMT:光信号到电脉冲信号
高灵敏度 —50MESF
FL-H FL-A
FL-W
面积(A):荧光总量 高度(H):最大荧光强度 宽度(W):细胞直径
(4)光学镜片
4
3
5 6 X 13 8
1/3
7 recip 9-22
Y 18 21 20
14 9-12
15 16 17
19 Ph 22
Chromomycin A3 GC
制备和设计流式样本
实验流程
制取单细胞悬浮液 荧光染色 上机检测
机械破碎,酶解消化,化 学解聚—去除碎步与团块
细胞吸收的荧光染料与其目 标分子含量成正比,荧光信 号强度与吸收的荧光染料分 子成正比
仪器校准和优化
数据分析
结合生理现象分析数 据
荧光染色设计的几个原则
• 了解仪器的激光/滤光片的组合 • 匹配荧光亮度与最低密度的目标分子 • 了解所用荧光染料的激发和发射谱 • 减小荧光光谱重叠 • 使用多杆激光,但需避免多重激发 • 小心使用组合染料(tandem dyes) • 设定合适的对照样本(调节荧光补偿
的样本)
(1)荧光补偿
发射光谱重叠带来干扰, 需要将其进行补偿
CD45 FITC (log)
R1=单核细胞 (CD14+ve) R2=淋巴细胞 (CD45>单核细胞) R3=粒细胞 (CD45<单核细胞)
前向散射光 (linear)
CD14 PE CD14 PE
一维图:直方图
对比:
双参数的二维图 能提供更多信息
细 胞
数
CD45 FITC CD45 FITC
细胞数
2)CD45以不同的密度存在于所有白细胞表面。 (淋巴细胞>单核细胞>粒细胞) 荧光染料:fluorescein isothiocyanate (FITC).
• 信号收集:FSC,SSC,PE/FITC双荧光信号。 • 细胞数:10,000。
二维图:散点图
CD14 PE (log) 侧向散射光(linear)
二.细胞分选原理
●高通量 ●高纯度:可达99.9% ●可分选极少含量的细胞 ●多种分选方式
FACSVantage Diva 的模拟四路分选。
四.实例与数据分析
(1)红细胞裂解后的外周血细胞检测
• 成分:样本中的细胞有单核细胞,淋巴细胞,粒细胞 • 染色:单克隆抗体标记
1)CD14存在于单核细胞表面。 荧光染料: Phycoerythrin(PE)
目录
• (一).流式细胞术的功能特点与应用 一.流式细胞仪的功能特点 二.流式细胞术的应用
• (二).流式细胞仪原理简要 一.流体动力学聚焦 二.荧光光信号检测 三.细胞分选 四.实例及数据分析
• (三).制备和设计流式样本 一.样本制备和实验流程 二.设计荧光染料组合的几个注意事项
• (四).流式细胞术的新发展
流式细胞术培训
科技文献数量增长的一个简单统计
美国国立生物技术信息中心 / PUBMED 查询:检索关键词: flow cytometry 结果:
1980.1以前: 142 1980.1—1990.1: 9450 1990.1—2000.1: 33459. 2000.1—2005.1: 28850 2005.1—2009.4.15: 29495