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流式细胞术实验方法及应用


2、阳性染色对照 用现有试剂和方法检测已知表达某种特 异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板CD62P时, 可用被ADP诱导活化血小板作为CD62P检测的阳性对照细 胞。
3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴 性细胞群,如CD3/CD19双染检测健康人性细胞群(主要是NK细胞),可作阴性对照。 4. 同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免 疫球蛋白亚型,如IgG-FITC、IgG-PE
荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于 <600个 (如FITC或PE);前向角检测到小于0.3um 颗粒。 分选感兴趣的细胞 纯度达99%,收获率可达90%。
流式细胞术的应用范围
细胞大小 细胞表面分子:CD系列 细胞浆内分子:胞内细胞因子 细胞核内分子:P53 细胞功能检测:细胞周期、细胞凋亡
其他:线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度
加OptiLyes C溶血素250ul
PBS洗一次
抗体:
上机分析
CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体


CD19-PE/CD3-FITC二标抗体 CD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体
IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型对照

淋巴细胞亚群检测临床意义:
育15-30min → 溶血素→ 室温10min → PBS洗1次
→上机分析(1% 多聚甲醛固定)。
2. 细胞浆或核内抗原标记法 收集单细胞悬(1×106)+固定剂A 去固定液 破膜剂B及抗体
室温,15 min 室温,15 min
洗涤
PBS洗涤1次
上机分析(1% 多聚甲醛固定)。
3. 细胞表面和细胞内抗原同时标记
速度快 极短时间内可分析大量细胞,每秒可检测上万 个
细胞,甚至几万个细胞。 多参数分析 可同时分析单个细胞的多种特性,获得单个细 胞多种信息,也可以根据其细胞表面标志的不同把 细胞群分为各亚群。
定性、定量分析细胞 通过荧光染色对单细胞的某些成分,如:DNA、 抗原或受体等进行定性、定量分析。 灵敏度高
参数的意义: FSC的强度与细胞的大小有关,也就是说,细胞越大, 散射光越强,细胞越小,散射光越弱; SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感,可反 映细胞颗粒性程度大小。 单参数直方图X轴代表荧光或散射光的强度,Y轴代该 道所具有相同光信号细胞的频率或相对的细胞数; 双参数散点图X轴和Y轴均代表散射光或荧光的强度.
流式细胞分析中常需要两种或两种以上不 同荧光素标记的单克隆抗体进行多色分析。由 于目前使用的各种荧光染料都是宽发射光谱性 质,发射光谱范围有一定的重叠,出现结果误 差,克服这种误差的有效方法就是使用荧光补 偿。

八、数据分析
流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行 分析,其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独 特的技术,是指在细胞分布图中指定一个范围或一 片区域(门),对其中的细胞进行单参数或多参数 分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形 门、任意门和四象门等。
细胞表型分析:
双色分析:FITC与PE
三色分析:双色分析+PE-CY5
四色分析:三色分析+ECD DNA含量分析: PI 凋亡与坏死分析: 凋亡用Annexin V-FITC/PI双染
四、标本的收集、单细胞悬液的制备
骨髓、外周血、细胞株、组织器官、 胸水、腹水、尿液脱落细胞等
1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备
周期分析
G0/G1 (2C)
S (2C→4C) G2/M (4C)
当人体癌变或者具有恶性潜能的癌前病变时, 在其发生、发展过程中可伴随有细胞DNA倍体及S期 的改变(异倍体) 恶性肿瘤细胞增殖周期的判断: S>10、G2/M>15或S>20、G2/M>5
白细胞分化抗原(CD分子)的命名:
1982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会, 将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划 分为25群,把每一群抗体称为一个分化抗体群 (Cluster of Differentiation,CD),进行编号、 命名,即为单克隆抗体的国际命名法。由CD抗体 群识别的分化抗原就称为CD分子。目前已有339个 分化抗体群被鉴定并命名
体时,将DNA含量直
方图分为三部分,
G0/G1 (2C)
S (2C→4C)
即G0/G1、S、G2/M
三个细胞峰。
G2/M G2/M
(4C) (4C)

方法:
细胞悬液(1*106) 70%冰乙醇
4º C ,24h
离心去固定液
30min
PBS洗2次
PI
避光,30min
RNase
上机
PBS洗1次
采集10000细胞,MultiCycle软件进行细胞
100目钢筛网过滤 300目尼龙 1000r/min,5min PBS 洗2次 单细胞
5. 脱落细胞单细胞悬液的制备
包括:
尿液脱落细胞
胸水、腹水脱落细胞 冲洗液脱落细胞
收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 沉淀 取底部10-20ml 300目尼龙滤网过滤 收集方法、沉淀时间
臵 4℃ 冰箱中 PBS洗 3 次
三、单克隆抗体标记荧光探针选择
1.了解激发光波长和发射波长
激发光波长(nm )
异硫氰酸(FITC) 488 发射波长(nm) 525(绿)
藻红蛋白(PE)
碘化丙啶(PI) 藻红蛋白偶联物(PECY5) 藻红蛋白偶联物(PECY7) 别藻青蛋白(APC)
488
488 488 488 633
575(橙)
在流式分析中通常需要细胞膜表面和细胞 内同时标记,首先标记表面抗原,然后再对细胞 膜和核膜进行固定破膜后再标记胞内或核内抗原。 常见细胞破膜剂:
0.05%皂角素、0.1%曲拉通 (Triton X-100)、70%乙醇、
商品化固定破膜剂(A、B)。
1、空白对照
用缓冲液(PBS)代替单克隆抗体进行实验
网搓法
组织块洗去血液 收集滤液 PBS 洗2次 100目钢筛网轻搓 单细胞悬液。 研磨器研至匀浆 100目钢筛网
生理盐水
1000r/min,5min
300目尼龙网过滤
离心
研磨法
组织块洗去血液 单细胞悬液。
300目尼龙网过滤
离心
1000r/min,5min
PBS洗2次
4. 石蜡包埋组织单细胞悬液的制备
醇乙脱水: 70%→80%→90%→ 95% →100%醇乙→二甲苯→石 蜡包埋 脱蜡水化: 二甲苯脱蜡→ 100%醇乙 →90%→80%→70%→50% →蒸馏水
石蜡包埋组织制备 单细胞悬液
石蜡包埋组织切片
乙醇,蒸馏水
二甲苯脱蜡 胰蛋白酶
1-2天
水化
组织器官
37℃,15-30min
冰PBS 网过滤 离心 悬液
骨髓及外周血都是天然的单个细胞,可直接标记, 再溶血。 单细胞的分离制备 分离液 离心 血液+生理盐水
2500r/min,20-30min
单个核细胞
单核细胞: 利用单核细胞在短时培养贴壁快 的特性(30-40min),可采用短时培 养获得较纯的单核细胞.
2、培养细胞样品的制备(贴壁细胞)
培养板 胰蛋白酶 吸去培养液
小鼠 兔抗小鼠
接抗体,只能采用此方法。
直接标记是在标记时加入连接着荧光素 的特异性抗体,该方法简单,目前广泛应用


于各实验室。
根据细胞部位的不同,可分为细胞表面和细胞内 抗
原染色,细胞内标记需要固定、破膜等步骤 1.细胞表面抗原的标记法(外周血为例 ) 全血50ul(5×105)+10ul相应抗体→避光孵
FSC
SSC
1、DNA含量分析 意义:肿瘤的早期诊断,肿瘤的良恶性判断,观察细胞的 增殖状态及细胞周期分布。 正常生物细胞,DNA含量随着细胞增殖周期时相而发 生变化。即G0/G1期(2C)、S期(2C→4C) G2/M期 (4C)。
2C→4C
2C
4C
FCM进行细胞周期DNA含量分析时,需要对 DNA进行染色,DNA染料(PI)与DNA结合具有特 异性,有一定量效关系,即DNA含量的多少与荧 光染料的结合量成正比,荧光强度与DNA吸收荧 光分子多少成正比。FCM分析一个 细胞群周期与DNA倍
37℃,室温,3-5min
PBS洗2次 含血清的培养基 单细胞悬液。
吹打
PBS洗2次
3. 组织器官单细胞悬液的制备
酶消化法
组织器官 机械法 单细胞制备仪 剪碎法 网搓法 研磨法
(1)、酶消化法
组织块洗去血液
酶 滤
37℃,15-30min
剪成小块
胰蛋白
含血清的培养基
100目钢筛网过滤
离心
300目尼龙网过
单细胞悬液
胸水、腹水:胸、腹水50-100ml,加入1000U/ml 肝
素液,臵于4℃ 冰箱中静臵 6-12h
尿 液:收集24h 尿液,臵4℃冰箱中自然沉淀 2h 冲洗液:300-500ml 生理盐水冲洗膀胱 ,冰箱内臵
6-12h


羊抗兔
五、荧光标记 主要包括间接免疫荧光染色和直接免 疫荧光染色两种方法。 间接标记是采用特异的无荧光标记的一 抗与待测标本反应后,洗去未结合抗体再加 入荧光标记的二抗,形成有荧光的抗原--抗 体--抗体复合物。其操作复杂、费时,目前 很少用。在科研中需要一些新的抗体没有直
流式细胞术实验方法及应用
科研型
分选功能 488nm激光
Our weapon:EPICS ALTRA Flow Cytosorter
四色荧光
(525、575、610
、675nm)
流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的 研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒, 经过高速的液流系统形成细胞柱,排列成单细 胞依次通过流动室,在激光照射区域,携带荧 光素细胞受激发产生不同的荧光信号,这些荧 光信号可以反映细胞的生物特性。
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