蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两方面的稳定因素，所以 作为胶体系统是相对稳定的。
(2)方法
①等电点沉淀：蛋白质在等电点时的溶解度最低。 ②盐析沉淀：中性盐的亲水性大于蛋白质分子，夺走水分子， 破坏水膜；同时又中和电荷，破坏亲水胶体。 ③有机溶剂沉淀：使蛋白质分子间的静电引力增加，水化作 用降低。 ④有机聚合物沉淀：聚乙二醇、葡聚糖、右旋糖酐硫酸钠等。
peptide或loop）：
连接二级结构单元，在肽链中出现频率较高的短肽，
长约1～5个残基。 •超二级结构（super－secondary structure）： 两个或者几个二级结构单元被连接肽段连接起来， 进一步组合成有特殊几何排列的局域立体结构。
结构域（domain）：蛋白质超二级结构形成的紧密、稳定而 且蛋白质分子构象上明显可分的区域， 它们承担着蛋白质分子不同的功能，是 整个蛋白质分子中的一些生物功能实体。
医学实验方法(4)
Methods of Medical Experiment (4)
蛋白质实验方法
第一节 第二节 蛋白质的结构 蛋白质分析技术
第一节 蛋白质的结构
一、相关概念
• 蛋白质(protein)：体现生命现象的一类生物大分子；含 C、H、O、N、S等元素；以氨基酸为 基本结构单元，以共价键连接构成的 不分支的线性序列分子。
• 构象（comformation）：分子内空间位置的改变，并不 涉及共价键的断裂和生成发生 的改变，单链旋转时，分子中 的基团或者原子可能形成不同 的空间排列和位置排列。又称 为空间结构、立体结构、高级 结构等三维结构。
二、氨基酸（amino acid，AA）
蛋白质的基本结构单位，20种L－α氨基酸
①连续密度梯度离心
②非连续密度梯度离心
2、沉淀法
（1）蛋白质胶体性质
①蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直径1-100nm之间的颗 粒，已达到胶体颗粒范围的大小，因而具有胶体溶液的通性。
②蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体： A、蛋白质多肽链上含有许多极性基团。如：－NH3＋、－COO－ 、 －OH－、-SH－、-CONH－等，它们都具有高度的亲水性，当与水接 确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜，将 颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。 B、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时，相同蛋白质颗粒带 有同性电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层。使蛋白质颗粒 之间相互排斥，保持一定距离，不致互相凝聚而沉淀。
氨基酸残基（residue）：肽链中的氨基酸分子因脱水缩合 而基团不全。
四、蛋白质结构的组织层次
蛋 白 质 的 结 构 层 次 一级结构
二级结构
空间结构 三级结构
超二级结构 结构域
四级结构
1、蛋白质的一级结构（primary structure）
蛋白质分子中氨基酸的排列顺序（主要的化学键是肽键）
不同生物与人的Cytc的AA差异数目
生物 与人不同的AA数目 0 1 9 10 11 12 13 14 15 21 23 25 31 35 43 44 黑猩猩 恒河猴 兔 袋鼠 牛、猪、羊、狗 马 鸡、火鸡 响尾蛇 海龟 金枪鱼 角饺 小蝇 蛾 小麦 粗早链孢霉 酵母
圆圈代表分歧点
根据细胞色素 C的 顺序种属差异建立 起来的进化树
这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿 舞蹈病、疯牛病等。
疯牛病中的蛋白质构象改变
疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人 和动物神经退行性(大脑淀粉样) 病变。 正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。 PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的 PrPsc，从而致病。
一级结构不同, 但空间构象极为相似
血红蛋白、肌红蛋白是氧的运载体， 分别存在于红细胞和肌肉中
第二节
蛋白质分析技术
一、 蛋白质的提取
抽提：是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离 出来的过程。 （一）蛋白质材料的来源 1、动物 （1）物种的不同，蛋白质氨基酸的序列有可能不同。 （2）尽可能接近正常状态下获得组织与器官。 （3）取出的组织和器官要迅速使用或冷冻保存（-80℃）。 2、植物 3、微生物 一般应在细菌的生长对数期的后半部份收集菌体。 4、基因工程产品
2、抑制蛋白水解酶
（1）改变提取液的pH，多数蛋白水解酶的最适pH为3～5， 提取液可以采用高于5的缓冲液。 （2）使用蛋白酶水解抑制剂。 （3）低温操作，应尽量保持温度在0～4 ℃ 。
（四）蛋白质的分离 1、离心法
（1）差 速离心用 于蛋白质 沉降系数 相差一个 数量级 （10倍） 以上的。
（2）密度梯度离心
2、蛋白酶抑制剂
（1）PMSF（苯甲磺酰氟）：抑制丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶。 （2）EDTA（乙二胺四乙酸）：抑制金属蛋白水解酶。 （3）aprotinin（胰蛋白酶抑制剂）：抑制丝氨酸蛋白酶。 （4）pepstatin（胃蛋白酶抑制剂）：抑制酸性蛋白酶。 （5）leupeptin（亮抑蛋白酶）：抑制丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶。
氢 键 疏水作用
盐 键
阴、阳离子借静电引力形成的键
一级结构： 肽键、二硫键 二级结构： 氢键 三级结构： 疏水作用、氢键、 离子键、范德华力 四级结构： 氢键、离子键
6、蛋白质的变性
一般说来
一级结构决定构象
构象决定生物活性
蛋白质的空间结构是实现蛋白 质生物学功能的基础 蛋白质构象异常可导致疾病
在外来理化因素的作用下，维系蛋白质空间结构的次 级键断裂，天然构象被破坏，生物活性丧失；溶解度 降低，对于球状蛋白粘度增加；光吸收系数增大；生 物化学性质改变。 一级结构和分子量不变。
。
4、四级结构（quaternary structure）
亚基（subunit）：三级结构的一条多肽链。 亚基之间相互作用形成的。具有生物活性的蛋白 质近似球形或者椭球形。
5、次级键
范德华力
范德华力是存在于分子间的一种吸引力，它比化 学键弱得多。一般来说，某物质的范德华力越大， 则它的熔点、沸点就越高。对于组成和结构相似 的物质，范德华力一般随着相对分子质量的增大 而增强。 与氢连接的原子具有电负性大、半径小、含孤 对电子的特点 ，如：N, O, F, Cl等 疏水即憎水，疏水分子之间并不相互吸引， 是在水分子的作用下而聚集在一起
O=C 0.123nm 键长=0.133nm N-C 0.145nm
肽键平面：组成肽键的4个原子和2个相邻的α 碳原子都处于 同一个平面内，此刚性结构的平面。
两相邻酰胺平面之间，能 以共同的Cα为定点而旋转， 绕Cα-N键旋转的角度称φ 角，绕C-Cα键旋转的角度 称ψ角。
肽、蛋白质是氨基酸的线性多聚体
牛胰岛素
核糖核酸酶A
2、蛋白质的二级结构（secondary structure）
在蛋白质一级结构的基础上，氨基酸之间以氢键维持盘旋或 折叠。主要是α -螺旋（ α - helix）和β -片层（ β pleated sheet），以及β - 转角和无规卷屈。
无规则卷曲
• 连接肽段（connecting
3、低温保存
4 ℃、-20 ℃、 -80℃和 -196℃（液氮） 短期（1周之内）和长期（超过1周）
4、冻溶
低温（ -20 ℃或 -80℃ ）至4 ℃解冻1天，然后室温溶解，溶解 过程要规则的均匀摇晃（勿产生气泡），减少沉淀产生。
二、 蛋白印迹（western blot）
蛋白质印迹：蛋白质经过聚丙烯酰胺凝胶电泳，使 蛋白质按分子大小分开后，通过电转 移使其固定于滤膜上，再与溶液中的 其他蛋白分子相互结合。其中常用抗 体检测，因此也称为免疫印迹技术 （immunoblotting），亦称为Western blotting（蛋白质印迹）。主要用于检 测样品中特异性蛋白质的存在、细胞 中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白 质分子的相互作用研究等。
•
•
4、过滤法
过滤（10um）、微过滤（0.1-10um）、超滤（0.01-0.1um）
（五）蛋白质的保存
1、冷冻干燥
CHRIST ALPHA2-4 LD plus 冷冻干燥机主要技术指标： •凝冰能力：最大4kg •凝冰效率：最大4kg/24h •冷室容积：6.5 L •制冷功率：2×370Kw •凝冰温度：-85℃ •冷室阱冷冻的温度：-50℃ •独立控制的外接口：12个 •控制器：LD plus •工作环境温度：10℃-32℃ 6 •机器大小：390×415×540mm
氨基酸的两性解离
紫外吸收性质（280nm）
大多数蛋白质含有色 氨酸和酪氨酸残基
茚三酮反应
原理：茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还 原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的 深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的 光密度，测定氨基酸的含量。
三、肽
肽键（peptide bond）：连接两个氨基酸的酰胺键。一个氨基 酸分子的α－羧基与另一个氨基酸分 子的α－氨基脱水缩合而成的酰胺键。
α -C
α -氨基
α -羧基
侧链R
对映结构体(手性 /question/5117897.html?fr=qrl3 ) 在化学中，组成相同但空间结构上互成镜像（对映体）的分子 叫手性分子。 能使平面偏振光按顺时针方向旋转的对映体称右旋体，记作(+) 或者D，反之称作左旋体，记作(-)或者L 。
按照极性分类: 1、非极性氨基酸，2、不带电荷的极性氨基酸，3、带正 电的碱性氨基酸，4、带负电的酸性氨基酸
按R基的极性性质可以分成以下4组：
非蛋白质氨基酸
天冬氨酸 谷氨酸 赖氨酸 碱性氨基酸 精氨酸 组氨酸 极性氨基酸
氨 基 酸
酸性氨基酸
蛋白质氨基酸 （20种）
色氨酸 蛋氨酸 丝氨酸 苏氨酸 半胱氨酸 酪氨酸 天冬酰胺 谷氨酰胺 中性氨基酸 丙氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 非极性氨基酸 苯丙氨酸 缬氨酸 甘氨酸 脯氨酸