3、蛋白质组研究的技术路线流程
二、蛋白质的提取与样品制备
样品制备原则
1、尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质损失。
（1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白。 （2）不同类型的蛋白质需要不同的方法
（3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法
2、细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，从特殊亚细胞器提取 蛋白还的分级分离。
度为0.1-0.15mM,能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。
4、蛋白质沉淀步骤
（1）硫酸铵盐析 原理：高盐将蛋白质沉淀出来，从而与核酸分离 步骤：蛋白质浓度>1mg/ml，缓冲溶液浓度>50mM(含EDTA),缓慢加 入(NH4)2SO4,搅拌10-30min，离心分离。 注意点：只用作预分离和富集，且(NH4)2SO4 会干扰IEF （2）TCA沉淀 三氯乙酸（终浓度10-20%）加到提取液中混均，置冰上30min，最后用 丙酮或乙醇清洗沉淀除TCA。该法不易造成蛋白质变性和化学修饰。 （3）丙酮沉淀 提取物加入3倍体积的冰丙酮，-200C沉淀2小时，离心空气干燥去丙酮。 （4）丙酮/TCA沉淀 用丙酮在10%的TCA中重悬样品溶液（含有0.01的ß -巯基乙醇或 20mmol/L),-200C沉淀45min,离心分离,丙酮清洗沉淀,空气干燥。 （5）苯酚提取 蛋白质提取到饱和酚中，加到甲醇溶液中NH4CA沉淀，然后先用NH4CA 洗涤，再用丙酮洗涤，空气干燥去丙酮。本法适合于高杂质的植物样品。
白。另外膜蛋白通常位于两相去污系统中相对较丰富的一相。
B、摸蛋白的特性 低丰度、大多偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中。
C、为了从二维电泳凝胶图谱中分离出膜蛋白，首先必须服从三个条件
a、必须保证膜的脂类环境，同时要避免过多的脂对IEF的干扰。 b 、必须以一种可溶的形式（通常是去污剂-蛋白复合物）从膜中分离出
5、清除影响二维电泳图谱的杂质
（1）盐、残留的缓冲液和电性小分子 盐等带电物质会干扰电泳过程、增大溶液电导率，通常用透析、凝胶过 滤、沉淀/重悬的方法脱盐，但易使样品丢失。 （2）内源性小分子 这些物质通常带负电，使阳极侧的聚焦不全，可采用丙酮/TCA沉淀去除。 （3）离子去污剂 SDS等离子去污剂，易和多肽形成复合物而干扰IEF，-200C的丙酮溶液 可除去。 （4）核酸 核酸增加样品黏度，导致二维电泳背景发散；能与蛋白质结合，阻碍聚 焦；银染时出现高背景。加0.1V的核酸酶溶液(1mg/ml DNAase+0.25 1mg/ml RNAase+50mmolMCl2)冰上孵育,但要注意核酸酶本身会出现在图谱中。 （5）多糖 多糖能阻碍凝胶孔径、与蛋白质形成复合物，可用(NH4)2SO4或苯酚NH4CA沉淀后离心，或用超速离心去多糖
使用注意点：
样品离心前在室温下至小保持1小时，使完全变性和溶解；样品含尿素不可加热， 已防蛋白修饰；样品类型不同，选择裂解液的组成也不同。
（二）蛋白质分步提取技术
Sample Preparation
Urea, thiourea
Triton X-100, NP-40, CHAPS, SB 3-10, ASB 14 DTT, DTE, TBP
蛋白质组学的基本研究方法
Outline
一、概述 二、蛋白质的提取与样品制备 三、蛋白质的分离与二维电泳技术 四、蛋白质的检测技术 五、生物质谱技术与蛋白质的鉴定 六、蛋白质构象解析技术
一、概述
1、蛋白质组学研究远比基因组研究复杂
（1）一个生物对象的蛋白质数量远大于基因数量
（2）基因组的组成是固定的，蛋白质组组成是动态的 （3）细胞内蛋白质的拷贝数（108）远比基因拷贝数大（105） （4）基因可采用PCR扩增和自动测序，而蛋白质还没有扩增和 自动测序技术
2、剧烈的细胞裂解方法
主要针对难破碎的细胞、酵母细胞和细胞亚组织 （1）超声裂解法：利用超声波产生的切应力破碎细胞，但要注意产
生热量和气泡
（2）研磨法:加液氮和沙进行研磨，适合于固体组织和微生物细胞。 （3）机械匀浆法：破碎固体软组织和动物组织（切成小片），同
时要加入预冷的匀浆溶液。
（4）玻璃珠匀浆法：适用细胞悬液或微生物，目的在于破碎细胞， 提取内含蛋白质，g细胞/3-4g玻璃珠，震荡1min,冰浴1min，反复操
3、样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于-80度，不要反复冻融样品。
4、通过超速离心清除所有的杂质。
主要去除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等
5、加入尿素之后，加温不要超过37度，以防蛋白质氨甲酰化。
（一）细胞裂解的方法
1、温和裂解的方法 适用于组成比较简单的样品或分析特定的细胞器
（4）肽蛋白酶抑制剂：价格贵，本身会出现二维电泳图中。
亮抑酶肽：在DDT中可逆抑制丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。 胃蛋白酶抑制剂A：作用对象为天冬氨酸蛋白酶。
抑蛋白酶A肽：作用对象为丝氨酸蛋白酶。
苯丁抑制素：作用对象为氨基蛋白酶。 （5）TLCK、TPCK：甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮、甲苯磺酰苯氨酰氯甲酮的工作浓
2、蛋白质组学研究技术进展
（1）1975年，2-DE技术建立
（2）上世纪80年代，固相化pH梯度凝胶问世，使2D-E的重复
性和加样量改善 （3）上世纪末期，MALDI-TOF-MS和ESI-MS可精确测定相对分 子量和微量 （4）快速多肽序列 （5）90年代，多图象分析与大规模数据处理软件问世，复杂 蛋白质图谱处理成为现实
核糖核蛋白及DNA结合区。 B、提取步骤：
细胞核在含0.5% TritonＸ－１００和１.2mM蛋白抑制剂的缓冲溶液中
匀浆数分钟—— 离心去脂类和可溶性蛋白—— 取沉淀,与提取液4℃反应 15min —— 离心除可溶性骨架蛋白——取沉淀在消化液内室温消化 30min —— 离心得核基质蛋白和中间丝—— 再溶于含8M尿素的裂解液 中—— 透析除尿素—— 离心得上清夜即为细胞核基质蛋白。 提取液：100mM KCl+3mM MgCl2 + 0.5% TritonX-100+12mM PMSF 消化液：50mM NaCl+3mM MgCl2 A。
即得核膜蛋白提取液。
B、进一步分级提取：核膜蛋白提取液+ TritonX-100 （终浓度0.5%） 或 NaCl （终浓度1M ）或 Urea （终浓度4M）—— 4℃震荡15min ——
13000rpm离心可得TX抗性蛋白及NaCl洗脱蛋白—— 50000rpm离心可得离液
剂抗性物质 C、常用溶液 TP缓冲溶液：10mM Tris-HCl pH7.4 + 10mM NaH2PO4 + 1mM PMSF+10 μ g/ml aprotinin + 10μ g/ml leupeptin + 250 μ g/ml heparin+ 1mM Na3VO4 + 10mM NaF+400U Benzon uclease STM0.25 缓冲溶液: 20mM Tris-HCl pH7.4+0.25M Sucrose+5mM MgSO4 + 1mM Na3VO4 + 1mM PMSF + μ g/ml aprotinin + 10μ g/ml leupeptin
（1）渗透裂解：通常用于血细胞、组织培养细胞等低渗溶液细胞 （2）冻融裂解：液氮快速冻融，然后在370C融化,反复几次,适合于细菌、组培细胞。 （3）去污剂裂解：溶解细胞膜释放内含蛋白质，主要针对组培细胞。
（4）酶裂解：在等渗溶液中用酶去细胞壁，常用的酶有溶菌酶（细菌）、纤维素酶+果胶酶
（植物）、溶细胞酶（酵母）
作。
3、蛋白酶抑制剂防止蛋白酶裂解 防止细胞裂解时蛋白酶释放出来降解蛋白质。低温pH>9的裂解液
可降低蛋白酶活性，但不能真正消除，故得加酶抑制剂（以下一种
或数种的混合物）。
（1）PMSF：苯甲磺酰氟，工作浓度1M，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨 酸蛋白酶，但在水溶液中失活。 （2）AEBSF：可在水溶液中使用，工作浓度4M，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、 半胱氨酸蛋白酶，但可能改变蛋白质的等电点。 （3）EDTA、EGTA：乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙酸的工作浓度为1M，作用对 象为金属蛋白酶。
μ g/ml DNase I 、 5 μ g/ml RNase A 。
对大部分细胞提取，第一步与第二步往往出现相同的图谱，最后一步因 膜蛋白提取出来而完全不同。若先将细胞器分级提取，再联合上述方法， 效果将更好。
（三）亚细胞蛋白质的提取
1、细胞中亚细胞的分离
据蛋白的大小和密度的差异进行分离。细胞破碎后，先低速离心从胞质溶 液中分离出细胞核和未破碎的细胞，得到上清溶液；随后对上清溶液进行密 度梯度分离，得到线粒体、溶酶体等亚细胞器；然后对亚细胞内的蛋白质进 行分离提取。
（6）脂类 脂类易和膜蛋白结合成复合物，改变蛋白溶解性、等电点和分子量， 采用大量去污剂可除去。 （7）酚类 通常出现在植物组织中，通过氧化反应修饰蛋白质，可用沉淀法去除， 或加抑制剂灭活多酚氧化酶。
6、裂解液的组成
目的：加入裂解液主要是确保一向等电聚焦之前样品的完全溶解和变形 组成：尿素+去污剂+（有时）还原剂 原理：
其实，目前鉴定的蛋白质只是整个蛋白质组的一小部分，主要是低 丰度的蛋白、疏水蛋白、膜蛋白及头发皮肤组织蛋白等的提取存在问题， 文献上介绍的方法也很难考虑上述所有情况。1998年 Molloy提出结合高
效裂解液分步溶解的技术路线。
1、水溶液提取，溶解亲水性蛋白质 5-15mg细胞+2ml 裂解液I（40mM Tris）——反复冻融3-4循环—— 加适量DNase I和 RNase A ——震荡混均、离心收集上清（沉淀留下一
3、含硫脲/SB3-10/TBP溶液的提取，溶解疏水性蛋白