CCGG N’ N’N’N’N’ CCGG
Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’
3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起 ２）富含ＧＣ
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四．限制酶的特点
３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’ 5’-GGATG(N)9
3’-CCTAC(Ｎ)13-5’ 3’-CCTAC(N)13
ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG
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第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等
3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一
亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸
识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。
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三. 限制性内切酶的定义、命名
1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制 酶。
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四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 １）识别４-8个相连的核苷酸
MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC
2. 命名：限制酶由三部分构成，即细菌种属名、菌系编号、 分离顺序。
例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离
到的第三个限制酶。
EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
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6、限制性内切酶的星号活性
引起星号活性的可能因素
甘油浓度过高 离子强度不合适 阳离子的变化 溶液中PH值的变化
在基因工程操作中，应避免星号反应的出 现
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二、限制酶的使用方法
用限制酶消化DNA（酶切）是基因工程 最基本的实验技术
最常用的消化条件： 反应体积：20ul 10xBuffer：2ul DNA浓度：0.5—1.0ul
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6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化，结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位 点，得到不同的酶切片断，这就是限制 酶的星号活性（star activity）
EcoR 1 GAATTC----AATT
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列．并使每条链的一个磷酸二
酯键断开的内脱氧核糖核酸酶 一 . 限制性内切酶的发现
1. 细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。
2. 限制酶HindII的发现 H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H.
5’-GOH
PAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
3’-CTTAAP
HOG-5’
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四．限制酶的特点
３） 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’
5’-CCC GGG-3’
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG CCC-5’
４）非互补的粘性末端
ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ
2. 末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’
5’-CTGCA
G-3’
3’-GACGTC-5’
3’-G
ACGTC-5’
２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoRI 5’-GAATTC-3’
specificity for DNA restriction modification and specificity） 位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、 SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。
2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两种基
因位于质粒上。
五. 异源同序酶（isoschizomer， 同裂酶）
1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两 种或多种限制 酶 2. 特点：1）识别相同顺序
2）切割位点的异同
KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG
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influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。
3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制
D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。
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二、限制修饰系统的种类
1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（host
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第二节 天然DNA的制备
天然DNA的来源
染色体DNA、病毒和噬菌体DNA、质粒 DNA、线粒体和叶绿体DNA
天然DNA的提取
准备生物材料 裂解细胞 分离和抽提DNA
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第三节 限制性核酸内切酶和DNA片断化