3 . 一般可在特异性识别序列内切割双链DNA分子 （有例外），产生链的断裂，断裂端有粘性末端和平 齐末端之分。其中两个粘性末端可以互补配对连结成 重组分子。
A.识别序列
• 识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。
• 回文序列的概念：具有特异性识别的反向重复序列称为回文 序列。
• 识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种， 它们都呈回文结构。
①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以 现在通行的是把全部略语字母写成一行。
②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶
四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
1. 为单链多肽, 最适pH6-8, 能被盐抑制、被Mg2+激 活； ，2. 底物DNA分子双链中有特异性识别序列，通常有 4-8个bP甚或更多，大都为一回文对称的结构（即识别 序列中有一个中心对称轴，若从这个轴向两侧方向 “读”，内容都是完全相同的，也称为反向重复序 列）。
2、发现 早在20世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠
杆菌不同菌株的平板培养效应的研究中，就发现了原
在限制--修饰系统中限制作用是指宿主细菌 可以通过自身限制酶的作用，破坏入侵的外源 DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生 物细胞的入侵受到限制，而保护了宿主菌；
而生物细胞(如宿主)的DNA分子合成后，通 过自身修饰酶的作用，使特定位置上的碱基发 生甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶 的破坏，这就是R--M系统中修饰作用的含义。
1978年 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因 发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献 获得诺贝尔奖。
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二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率
1、类型
特性 （7项）
I型
II型
III型
限制和修饰活 性
单一多功能的 酶
分开的核酸内 切酶和甲基化 酶
具有一种共同 亚基的双功能 的酶
• 以其功能可分为三大类：核酸降解酶类、核酸合 成酶类、核酸修饰酶类
第一节
限制性核酸内切酶和DNA片段化（九个问题）
一、限制性内切酶的发现 二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 三．核酸内切限制酶的命名原则 四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 五．影响核酸内切限制酶活性的因素（5点+1） 六. 限制性内切酶反应的终止 七、限制酶消化反应的步骤 八. 使用限制酶的注意点（4点） 九、DNA的片段化
基因工程工具酶
基因工程工具酶
• 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功 能的酶类。
• 这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和 修复等反应中具有重要作用，有的酶还具有微生 物区别自己DNA和非己DNA的功能，进而作为 降解非己DNA的防御工具。
• 在研究掌握了最好的基因工程“工 具”。
酶的识别序列是6 bp时，则其切割频率 为(1/4)6 =1/4096，即每隔4.1kb就可能
有一个切割点。 当识别序列为n个 bp， 则其切割频率为（1/4）n 。
三．核酸内切限制酶的命名原则
由于发现了大量的限制酶，所以需要有一 个统一的命名法。H．O．Smith和D． Nathans(1973)提议的命名系统，已被广大学者 所接受。他们建议的命名原则包括如下几点： （1） 用属名的第1个字母（大写）和种名的头 2个字母（小写），组成3个字母的略语表示寄主 菌的物种名称。例如，大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。
核酸内切限制 酶的蛋白质结 构
3种不同的亚基
单链多肽
2种不同的亚基
切割位点距 离识别位点 的情况
甲基化作用 的位点
在距寄主特 异性位点至 少1000bp的 地方可能随 机寄地主切特割异 性 的位点
位于寄主特 异性位点内 或其两侧
寄主特异性 的位点
距寄主特异 性位点3，端 24~26bp处
寄主特异性 的位点
识别未甲基 能
能
能
化的序列进
行核酸内切
酶切割
序 列 特 异 的 不是
是
是
切割
D N A 克 隆 中 无用 的用处
十分有用
用处不大
切割频率
---是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期的切割概率。 有了它，又知道DNA序列的长度，就可以估算该限制性核酸 内切酶在某种DNA分子中的切点数N。
但前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、识别序列在DNA 分子上是随机分布的。 因为所有的DNA分子都是由4种 脱氧核苷酸组成的，每一种出现的概率即为1/4 。如果某限 制性核酸内切
（4）名称： 限制酶，核酸内切限制酶用R表示 外，还要带有系统的名称，例如，流感嗜血菌核 酸内切酶 R．HindIII；
修饰酶，则在它的系统名称之前加上甲基化 酶M表示。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感 嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M. HindIII。
但在实际应用上，这个命名体系已经作了进 一步的简化：
限制性核酸内切酶的命名
Escherich Coli ia
Ry13
EcoR I
属名
种名
株系
编号
若种名头2个字母相同则其中一个可用种名 的第一和第三个字母。
（2） 用一个写在右下方的标注字母代 表菌株或型，例如Ecok、 Hind 。
（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几 个不同的R-M体系时，则以罗马数字表 示。例如，流感嗜血菌Rd菌株的几个限 制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、 HindIII等等。
A B C C’ B’
A’
或
A’ B’ C’ C
BA
A B N B’ A’ 或
A’ B’ N’ B A
A B B’ A’ A B B’ A’
不同核酸内切酶的特异识别位点
一、限制性内切酶(restriction enzyme)的发现 1．限制性核酸内切酶：
---是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核 苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书 》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已 从各种不同的微生物当中，分离出2 300种以上，可 识别230种不同的DNA序列。