天津医科大学 李会强
上？ – 酶免疫组织化学技术有何优点？
天津医科大学 李会强
实验三 酶联免疫试剂盒的研制
（设计性实验）
实验目的
• 熟悉酶联免疫试剂盒研制要点 ➢ 抗原纯化与抗体制备 ➢ 制备酶标记抗原（或抗体） ➢ 方法选择与设计 ➢ 筛选抗体（抗体匹配） ➢ 优化反应条件
实验相关知识简介
• 理论知识
酶联免疫吸附试验
• 本实验以双抗的基本 原理。
实验原理
• 双抗体夹心法
筛选两种抗-HBsAg（针对不同抗原表位），一种连接 于固相载体制备酶标反应板；另一种标记过氧化物酶制备 酶标抗体。测定时，待测抗原分别与固相抗体和酶标抗体 结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体双抗体夹心复合物。
结果判断
• 绘制标准曲线
– 采用Logistic曲线拟合 – 剂量反应曲线
注意事项
• 准确使用微量加样器
• 所有试剂需平衡至室温 • 加入试剂或标本后需轻轻振荡 • 洗涤过程要标准化
实验讨论
• 问题:
– HBsAg定量分析的临床意义？
– 酶联免疫吸附试验的注意事项？ – 如何检测抗-HBsAg？
– 洗涤充分 – 湿盒中反应，防止干片
• 镜检时，注意区分特异和非特异
结果分析
采用高倍镜观察计数。将待检载破片置 普通光学显微镜下观察，阳性细胞呈棕黄色， 计数200个细胞，计算CD3+细胞的百分比。
实验讨论
• 思考题：
– 酶免疫组织化学技术的影响因素有哪些？ – 在酶免疫组织化学技术中，为何不直接将酶蛋白标记在抗体分子
实验材料
• ELISA试剂盒
预包被抗体酶标反应板 系列标准品抗原 酶标抗体（抗HBsAg-HRPO） 质控血清 显色底物 终止液 浓缩洗液
实验方法
• 制备酶标板
– 包被 – 封闭
• 实验准备
– 标本编号 – 所有试剂平衡至室温 – 稀释洗液
实验方法
• 操作步骤
– 加标准品或待测样本，37℃温浴30 min； – 洗涤3~5次，加酶标记抗体； – 37℃温浴30 min； – 洗涤3-5次，加显色液A和显色液B； – 室温15 min，再加入终止液; – 读取A450nm
A值
0.054 0.330 0.456 0.779 1.231 1.726 2.397
实施策略
• 两种方式拟合
– 四参数Logistic曲线拟合 – Logit-log 直线回归
总结与讨论
• 问题：
– 直线回归有几种常用方式？说明各自特点。 – 曲线拟合有几种常用方式？说明各自特点。 – 如何评价剂量反应曲线拟合方式？
• 二抗（桥联抗体）：
兔抗鼠Ig
实验方法
• 分离外周血单个核细胞
采用密度梯度离心法分离
• 制片 • 免疫反应
– 加一抗，37℃ 60 min – 洗涤玻片3次 – 同时加桥联抗体和PAP复合物， 37℃ 30 min – 洗涤玻片3次 – 加底物显色 – 镜检
注意事项
• 制片时，细胞均匀，密度适中 • 免疫反应过程中，
– 线性回归法
– logistic曲线拟合
实验相关知识简介
• 理论知识
– 基本变量 分析物浓度和信号强度
– 免疫分析的特殊性 待测物浓度影响反应速率 曲线拟合方式影响测定结果
实验要求
• 题目：
– 根据所给数据，绘制标准曲线或得出数学模型。
CEA浓度 （ng/ml）
0
10 20 50 100 200 400
• 本实验以辣根过氧化物-抗辣根过氧化物免疫组 化技术检测成熟CD3+ T细胞为例，对这一技术的 原理和操作流程进行验证。
实验原理
• 要点：
– 特异性抗体识别抗原 – PAP复合物的放大效应 – 桥联抗体连接作用
实验材料
• 一抗（识别抗体）：
抗CD3抗体
• PAP复合物：
过氧化物酶 抗-过氧化物酶
总结与讨论
• 问题：
– 研制酶联免疫试剂盒需做哪些准备工作？ – 如何根据待测物质特性选择合适反应类型？ – 双抗体夹心法如何进行抗体匹配实验？ – 理想剂量反应曲线应具备哪些条件？
天津医科大学 李会 强
实验四 定量酶免疫分析中标准曲线的
数学模型
（设计性实验）
实验目的
• 掌握常用标准曲线数学模型
酶联免疫检测技术
实验一 酶联免疫吸附试验
（验证性实验）
实验目的
• 验证酶联免疫吸附试验的基本原理
➢ 掌握双抗体夹心酶联免疫法的基本原理 ➢ 掌握酶联免疫试剂盒的基本组成 ➢ 熟悉酶联免疫操作方法
实验内容简介
• 酶联免疫吸附试验是最常用的酶联免疫分析技术，
有四种基本类型：夹心法（双抗体夹心和双抗原 夹心）、间接法、竞争法、捕获法。
• 相关技术
– 蛋白纯化 – 酶标记化合物制备 – 酶标反应板制备
实验要求
• 题目：
假设需采用酶联免疫法测定某种肿瘤标志物，设计实 验如何制备酶联免疫试剂盒？
• 要求：
– 设计实验方案，绘制技术路线图 – 说明重要实验内容和实验方法
实施策略
• 重要环节：
– 纯化抗原和制备抗体 – 方法学选择与设计 – 抗原抗体选择 – 抗体匹配（双抗体夹心法） – 确定工作浓度 – 优化反应条件
天津医科大学 李会强
实验二 酶免疫组织化学染色技术
（验证性实验）
实验目的
• 验证酶免疫组织化学技术的原理
➢ 掌握PAP-酶免组化法的检测原理 ➢ 熟悉PAP-酶免组化技术操作要领
实验内容简介
• 酶免疫组织化学技术集抗原抗体结合的特异性、 酶免疫分析的敏感性和组织化学技术的直观性特 点为一体，常用于细胞鉴定、抗原定位、病理组 织观察等方面。