一、实验课题名称
不同环境条件下植物叶绿素a、b含量的比较（分光光度法测定）
二、文献综述
1.叶绿素a的生物合成过程
起始物是谷氨酸，之后为5-氨基酮戊酸，两分子的ALA缩合形成胆色素原(PBG),4分子PBG相互连结形成原中卟啉IX.原卟啉IX与Mg结合形成Mg-原卟啉原IX，光下E环的环化形成，D环的还原作用和叶绿醇尾部的连接完成了整个合成过程，合成过程中的许多步骤在图中已省略
2.影响叶绿素形成的条件
（1）光光是影响叶绿素形成的主要条件。
从原叶绿素酸酯转变为叶绿酸酯需要光，而光过强，叶绿素又会受光氧化而破坏。
黑暗中生长的幼苗呈黄白色，遮光或埋在土中的茎叶也呈黄白色。
这种因缺乏某些条件而影响叶绿素形成，使叶子发黄的现象，称为黄化现象(etiolation)。
也有例外情况，例如藻类、苔藓、蕨类和松柏科植物在黑暗中可合成叶绿素，其数量当然不如在光下形成的多；柑橘种子的子叶及莲子的胚芽在无光照的条件下也能形成叶绿素，推测这些植物中存在可代替可见光促进叶绿素合成的生物物质。
(2)温度叶绿素的生物合成是一系列酶促反应，受温度影响。
叶绿素形成的最低温度约2℃，最适温度约30℃,最高温度约40℃。
秋天叶子变黄和早春寒潮过后秧苗变白，都与低温抑制叶绿素形成有关。
高温下叶绿素分解大于合成，因而夏天绿叶蔬菜存放不到一天就变黄；相反，温度较低时，叶绿素解体慢，这也是低温保鲜的原因之一。
(3)营养元素叶绿素的形成必须有一定的营养元素。
氮和镁是叶绿素的组成成分，铁、锰、铜、锌等则在叶绿素的生物合成过程中有催化功能或其它间接作用。
因此，缺少这些元素时都会引起缺绿症(chlorosis)，其中尤以氮的影响最大，因而叶色的深浅可作为衡量植株体内氮素水平高低的标志。
(4)氧缺氧能引起Mg-原卟啉IX或Mg-原卟啉甲酯的积累，影响叶绿素的合成。
(5)水缺水不但影响叶绿素生物合成，而且还促使原有叶绿素加速分解，所以干旱时叶片呈黄褐色。
通过对室外旱池处理条件下的甘薯叶片叶绿素含量变化的研究，结果表明，水分胁迫下甘薯品种叶片中叶绿素a、b及总叶
绿素含量比对照均有所下降，叶绿素a/b比值比对照也有所下降，且叶绿素a/b比值占对照百分率与品种抗旱性呈极显著负相关。
【1】张明生，谈锋水分胁迫下甘薯叶绿素a/b比值的变化及其与抗旱性的关系[期刊论文]-种子2001（4）
在小麦的整个生育期内(完熟期除外),小麦叶片的叶绿素含
量呈现上升的趋势,这与小麦光合能力的增强密切相关.在不同生育期,遮光对小麦叶片的叶绿素a,叶绿素b和总叶绿素含量影响不同，这可能与小麦生长中心的改变有光。
随着遮光程度的增加，小麦叶片的叶绿素a/b值逐渐减小，说明叶绿素b的增加幅度快于叶绿素a，植物通过增加叶绿素b的相对含量来增加对蓝光的吸收，这种能力与遮光程度呈正相关，是对遮光的适应性表现。
【2】杨渺，毛凯，苟文龙等遮荫胁迫对叶绿素含量的影响【J】.四川草原，2004（3）：20—22。
三、实验目的与要求
熟悉在未经分离的体色叶绿素溶液中测定叶绿素a和叶绿素b的方法及其计算。
四、实验条件（包括实验材料、药品、仪器设备等）
1、实验仪器：分光光度计、离心机、台天平、剪刀、研钵、
移液管
2、实验试剂：丙酮、碳酸钙
3、实验材料：火棘新老叶片
五、实验原理与方法：
外界环境因子（如光照、温度、矿质元素等）的变化会影响物叶绿体色素的含量。
如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lamber-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对吸光度的影响，最后分别得到两种组分的含量。
叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663 nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。
根据Lambert－Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光度A之间有如下的关系。
OD663 = 82.04 Ca+9.27Cb
OD645= 16.75 Ca+45.60Cb
经过整理之后，得到下列公式
Ca=0.0127OD663－0.00269OD645 …………（１）
Cb=0.0229A645—0.00468A663 ……………（２）经过整理之后，把Ca、Cb的浓度单位从原来的g／L改为mg ／L，则可改写为下列形式：
Ca=12.7A663－2.69A645 (3)
Cb=22.9A645—468A663 (4)
CT＝Ca＋Cb=8.02 A663+20.21A645 (5)
式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。
利用上面公式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度。
六、实验方案或实验步骤设计：
1、实验材料的培养和处理:试验前采用不同环境条件对材料进行培养越一周后进行测量．
2、色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎片，称取0.25放入研钵中加纯丙酮2.5ml。
少许碳酸钙和石英砂，研磨成浆，再加80%丙酮2.5ml，将匀浆转入离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清夜用80%丙酮定容至１0ml。
3、测定光密度：取上述色素提取液1ml，加80%丙酮4ml 稀释后转入比色杯中，以80%丙酮作对照，分别测定663nm，645nm处的光密度值。
4、按公式（3）（4）（5）分别计算色素提取液中叶绿素a 叶绿素b及叶绿素a +叶绿素b的浓度。
再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。
新叶：Ca=12.7×0.209-2.69×0.79=2.4417mg/L
Cb=22.9×0.079-4.68×0.209=0.83098mg/L
每克叶片中 ma=2.4417÷0.5÷10000=4.8834×10-4g
mb=0.83098÷0.5÷10000=1.66196×10-4g
老叶：Ca=12.7×0.123-2.69×0.04=1.4545mg/L
Cb=22.9×0.04-4.68×0.123=0.34036mg/L
每克叶片中 ma=1.4545÷0.5÷10000=2.909×10-4g
mb=0.34036÷0.5÷10000=6.8072×10-5g
八、实验结果与分析
结果：每克老叶叶绿素含量：
叶绿素a：2.909×10-4g
叶绿素b：6.8072×10-3g
每克新叶叶绿素含量：
叶绿素a：4.8834×10-4g
叶绿素b：1.66196×10-5g
新叶叶绿素含量大于老叶
结果分析：
1、叶绿素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因
素，如干旱、盐渍、低温、元素缺乏都可以影响叶绿素的
含量。
2、在不同环境或生长状况不同的叶片中，如新叶与老叶中叶
绿素的含量不同，老叶中的叶绿素含量比新叶少可能是由
于Mg元素的转移，而Mg是组成叶绿素的重要元素之一。
3、由实验结果可知，叶绿素a的含量比叶绿素b的高，且比
例大约为3:1，这可能是由于有一部分叶绿素a并不仅仅
参与吸收和传递光能，还有光能转换的作用，使得叶绿素
a比叶绿素b含量高；老叶中的叶绿素明显比新叶中的少，
则可说明叶片开始衰老后，叶绿素大部分被分解或转移，
或者，叶绿素分解或转移的速度比其合成速度快。
九、实验小结
1、实验选取材料的新老叶要有代表性，区别要明显。
2、为研磨时间了避免叶绿素的光解，操作时要在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。
2、学会采取近似的处理方法，如植物叶片中含有水分，先用纯丙酮进行提取，使色素提取液中丙酮的最终浓度近似80％。
3、由于叶绿素a，叶绿素b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光度计。
4、叶绿素对植物、对我们的贡献作用是不可忽视的，我们应该保护植物、爱护植物，做一名环保卫士。