网络出版时间：2012-12-19 08:52网络出版地址：/kcms/detail/11.2206.TS.20121219.0852.010.html2012-11-20超氧阴离子自由基荧光探针法检测及其应用研究赵永强1,2，林洪1，李来好2,*，杨贤庆2，郝淑贤2，张牧天3(1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003；2.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东广州 510300；3. 北京师范大学-香港浸会大学联合国际学院，广东珠海 519085)摘要：该研究以2-氨基吡啶与吡啶-2-甲醛为原料，经亲核取代反应合成了一种新型荧光探针：2-（2’-吡啶亚胺甲基）吡啶（2-APC），所得目标产物经熔点测定、元素分析、红外光谱与核磁共振波谱等方法表征确认。
利用2-APC与超氧阴离子自由基（O2·-）发生荧光淬灭反应的原理，建立了一种测定邻苯三酚自氧化体系产生O2·-的方法，该方法反应体系最佳条件为：反应pH=8.2；反应温度T=40℃；反应时间t=40 min。
测定条件为：λex=295 nm、λem=365nm，狭缝宽度5 nm。
邻苯三酚在0.4×10-6~8.0×10-6 mol•L-1浓度范围内与相对荧光强度呈良好线性关系，线性回归方程为y=37.567x+55.581，R2=0.9834。
应用该方法对L-抗坏血酸清除O2·-能力进行评价，结果表明L-抗坏血酸清除O2·-的IC50值为0.182 mmol•L-1。
关键词：超氧阴离子自由基；荧光探针；合成；应用Fluorescence Probe Method for Superoxide Anion Radical Detection and its Application Study ZHAO Yong-qiang 1,2，LIN Hong1，LI Lai-hao2,*，YANG Xian-qing2，HAO Shu-xian2，ZHANG Mu-tian(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, P.R.China；2.Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, National R&D Center for Aquatic ProductProcessing, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Guangzhou510300, P.R.China；Beijing Normal University-Hong Kong Baptist University United International College, Zhuhai 519085,P.R.China)Abstract：A novel fluorescence probe 2-APC was synthesized by 2-aminopyridine and 2-pyridinecarbaldehyde basedon nucleophilic substitution reaction in this study. The reaction product was characterization by melting test,elemental analysis, infrared spectrum and 1HNMR. A fluorescence probe method for superoxide anion radicaldetection was established. The optimum conditions of this reaction system were as follows, pH, temperature and timeof reaction system was 8.2,40 ºC and 40 min respectively. The conditions of fluorimetric determination were asfollows, λex=295 nm, λem=365nm and the slit width was 5 nm. In the range from 0.4×10-6 M to 8.0×10-6 M, relativefluorescence intensity (y) and pyrogallol concentration (x) were shown a good linear relationship,y=37.567x+55.581，R2=0.9834. Superoxide anion radical (O2·-) scavenging activity of L-ascorbic acid wasevaluated using the above mentioned method, the results showed that the IC50of L-ascorbic was 0.182×10-3mol•L-1.Key words：superoxide anion radical, fluorescence probe, synthesis, application中图分类号：O657.34 文献标识码：A 文章编号：活性氧是需氧生物细胞进行正常代谢的产物，生物体生命代谢过程中通过非酶反应与酶反应不断产生各种活性氧自由基，如超氧阴离子自由基（superoxide anion radical, O2·-）、过氧化氢（hydrogen peroxide,收稿日期：2012基金项目：国家科技支撑计划项目(2012BAD28B00)；国家现代农业产业技术体系(CARS-49)；国家海洋局海洋公益性行业科研专项(201005020；2013418018)；茂名市科技计划项目(2011A01002)作者简介：赵永强(1985—)，男，博士研究生，研究方向为水产品加工及贮藏工程。
E-mail：zhaoyq1122@*通信作者：李来好(1963—)，男，研究员，博士，研究方向为水产品加工与质量安全。
E-mail：laihaoli@H2O2）与单线态氧（singlet oxygen, 1O2）等。
有文献报道每人每日约有1%~3%的摄入氧转变为O2·-及其活性衍生物[1]。
适当水平的活性氧可维持机体正常生理功能，而当机体中活性氧积累到一定浓度时可对机体生物分子造成损伤，从而引起多种疾病。
一些文献报道称活性氧与高血压[2]、动脉粥样硬化[3,4]、呼吸道窘迫综合征[5,6]、老年痴呆症[7,8]、肿瘤[9,10]、糖尿病[11,12]与衰老[13,14]有比较密切的关系。
近年来，自由基检测方面的研究受到越来越多的研究者关注。
目前自由基的检测方法主要有：电子顺磁共振法（electron paramagnetic resonance, EPR）、高效液相色谱法（high-performance liquid chromatographic, HPLC)、电化学法（electrochemical method）、化学发光法（chemiluminescence method）与荧光探针法（fluorescence probe method）[15-19].其中EPR法是对自由基进行直接检测的唯一方法，但仪器昂贵不适于常规分析。
近几年，荧光探针法广泛应用于细胞中自由基的实时检测。
不同类型的荧光探针可用于O2·-、1O2及羟基自由基（hydroxyl radical，·OH）的荧光法检测。
该类检测方法的重点为合成高选择性、高灵敏度及具有良好荧光光谱特性的新型荧光探针。
该研究基于亲核)吡啶（2-APC）L-抗坏血酸（11.12-美国SIGMA1.2pH计德国公司，司。
1.3 方法1.3.1后加入5.36 g 吡啶-2-甲醛与40 mL甲苯的混合液。
室温下搅拌10h后布氏漏斗抽滤，滤液置于旋转蒸发仪中减压蒸馏，蒸出大部分溶剂后，用无水乙醇重结晶，于真空冷冻干燥机中干燥得淡黄色粉末。
熔点：114.7～116.0℃；元素分析（%）C11H9N3，试验值（计算值）：C 71.96（72.12），H 4.86（4.95），N 22.81（22.93%）；IR( KBr pellet), ν/cm-1：3294.6（O-H），3049.6, 3008.9, 2480.5, 1955.7, 1599.6（C=N）；1HNMR(CDOD) δ=5.2～8.5(m, 9×CH), 其中δ=8.36(s, 1H, CH=N)。
31.3.3 荧光淬灭法测定O2·-该研究以邻苯三酚碱性条件自氧化体系产生的O2·-为测定对象，测定原理为：O2·-会破坏2-APC的-C=N-基团而使2-APC荧光强度降低（荧光淬灭现象），且O2·-含量与2-APC荧光强度降低值（ΔF）呈正比。
于10 mL比色管中依次加入2.00 mL Tris-HCl缓冲溶液（pH=8.20, 0.4 mol•L-1）, 0.3 mL 2-APC乙醇溶液（4.0×10-4mol•L-1），2.0 mL邻苯三酚溶液（4.0×10-4mol•L-1），超纯水定容至刻度，摇匀，于40℃水浴锅中水浴40 min。
选用1 cm石英比色皿，设置λex=295nm、λem=365nm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm测定其荧光强度，记为F。
同时做邻苯三酚空白试验并测定其荧光强度记为F0，则ΔF=F0-F。
每组试验3个平行。
1.3.4 O2·-清除率试验在1.3.3所述测定体系中加入不同体积L-抗坏血酸溶液（2.0×10-3 mol•L-1），测定其荧光强度记为F Vc；并测定未添加抗坏血酸的体系的荧光强度记为为F0；未加清除剂抗坏血酸且不加邻苯三酚的空白体系，其荧光强度为F；由于L-抗坏血酸可与2-APC反应而使其荧光强度降低（记为F j），因此计算清除率时应扣除此影响，L-抗坏血酸对O2·-清除率Q的计算公式为：Q(%)=(F Vc+F j-F0)/(F-F0)×1002 结果与分析2.1 最大激发波长与发射波长的确定选用1 cm石英比色皿、狭缝宽度5 nm对2-APC进行最大激发波长（λex）与发射波长（λem）扫描，结果如图1所示。