1、超氧负离子黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统产生超氧负离子产生超氧负离子黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、清除超氧自由基负离子O2-徐艳,曲婷婷. 甘草消除氧自由基的体外研究[J]. 食品研究与开发,2006,(8).2、1.2.2NBT 光还原反应中主要试剂的配制1.2.2.1 测试缓冲液:0.026 mol/LMet- 磷酸钠缓冲液具体配制方法:首先配制0.1 mol/LpH7.8Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液a 称取Na2HPO4·12H2O( MW=358.14) 3.581 4 g 于100 mL 小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 移入100 mL容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。
b 称取NaH2PO4·2H2O(MW=156.01)0.780 g 于50 mL小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。
c 量取91.5 mL a 液与8.5 mL b 液混合后, 该液即为0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液。
d 称取L- Met( MW=149.2) 0.194 1 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液定容至刻度。
1.2.2.2 NBT( 氯化硝基四氮唑蓝) 的配制(7.5×10-4mol/L)称取NBT( MW=817.7) 0.061 3 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解后, 移入100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。
1.2.2.3 核黄素溶液(2×10-5 mol/L)a.称取EDTA( MW=292) 0.002 92 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解。
b.称取核黄素( MW=376.36) 0.073 5 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解。
合并 a 液和 b 液, 移入100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度( EDTA0.1 mmol,核黄素2 mmol)。
贮于冰箱中, 避光保存, 用时稀释100 倍。
1.2.3 甘草提取物溶液的配制1.2.3.1 甘草酸溶液的配制称取甘草酸0.05 g 用少量稀醇(10 %乙醇溶液)溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用稀乙醇定容至刻度, 即为 1 g/ mL 的甘草酸溶液。
1.2.3.2 甘草次酸溶液的配制称取甘草次酸0.05 g 用少量稀醇(10 %乙醇溶液)溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用稀乙醇定容至刻度,即为 1 g/mL 的甘草次酸溶液。
1.2.3.3 甘草总黄酮组溶液的配制称取甘草总黄酮0.1 g 用少量稀碱液( 0.01 mol/LNaOH 溶液) 溶解后, 移入100 mL 容量瓶中, 用稀碱液定容至刻度, 即为1 g/L 的甘草总黄酮碱溶液。
( 甘草总黄酮全部溶解)1.2.4NBT 光还原法消除氧自由基原理核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2-, 当加入NBT 后, 在光照条件下, 与超氧自由基反应生成单甲月替( 黄色) , 既而还原成二甲月替( 呈兰色) 。
该产物在560 nm 下有最大吸收峰。
当加入抗氧化剂1.2.5 甘草消除氧自由基活性测定1.2.5.1 对照组吸光度的测定取 3 个微烧杯, 编好号后, 以反应系统总体积为 3.0mL计算, 按表 1 加入各试剂。
试剂加入后充分混匀,取0 号微烧杯放入暗处作空白( 调零时用) , 在560 nm波长下测定光密度。
1.2.5.2 各组提取物活性的测定以反应系统总体积为 3.0 mL 计算, 按表 2 加入每组试剂和提取液量。
在560 nm 波长下测定光密度, 以1, 2 号杯的A 值为对照计算出不同提取物溶液是否抑制NBT 的光还原反应, 及具有抑制作用的提取物在其反应系统中抑制NBT 光还原的相关百分率。
然后以所加提取物溶液量为横坐标, 以抑制百分率为纵坐标作图, 画出两者的相关曲线, 找出50 %抑制率的各溶液的量, 此提取物溶液量即为该物质一个活力单位清除·OH丛媛媛. 新疆胀果甘草多糖的分离纯化、结构分析和生物活性研究[D]. 新疆医科大学: 新疆医科大学,2008.对羟自由基（·OH）的清除实验按照Smirnof（1989）的方法，利用H2O2与Fe2+混合产生·OH 在体系内加入水杨酸捕捉·OH 并产生有色物质，该物质在510nm 下有最大吸收。
反应体系中含9.8mmol/L H2O22mL，9mmol/LFeSO42mL，9mmol/L 水杨酸-乙醇2mL，不同浓度的甘草多糖溶液2mL。
最后加H2O2启动反应，37℃反应30min;以超纯水为参比，在510nm 下测量各浓度的吸光度。
考虑到多糖本身的光值，以9mmol/L FeSO42mL，9mmol/L 水杨酸-乙醇2mL，不同浓度的多糖溶液2mL 和2mL超纯水作为多糖的本底吸收。
并以下式计算其清除率：清除率（%）=[（A0－（Ax－Ax0））/A0]×100%其中：A0 为空白对照液的吸光度；Ax 为加入多糖溶液后的吸光度；Axo 为不加显色剂H2O2多糖溶液本底的吸光度。
清除O2·1.2.2.3 胀果甘草多糖对超氧阴离子自由基（O2·）的清除实验1）采用邻苯三酚自氧化法的测定取5mL PH 8.2 的50mmol/L Tris-HCI 缓冲液。
2mL 超纯水，混匀后在25℃水浴中保温20min。
取出后立即加入在25℃预热过的3mmol/L 邻苯三酚0.5mL（以10mmol/LHCI 配制，空白管用10mmol/LHCI 代替邻苯三酚的HCI 溶液），迅速摇匀后倒人比色杯，420nm 下每隔30s 测定吸光度值。
2）样品活性测定在加入邻苯三酚前，先加入一定体积的多糖溶液，超纯水减少，然后按采用邻苯三酚自氧化法测定的方法操作，并计算抑制率。
抑制率（I%）计算公式为：I%=[1－（A3－A4）/（A1－A2）]×100%A1：不含样品的吸光度值；A2：不含样品和邻苯三酚的吸光度值A3：含有样品的吸光度值；A4：含样品，但不含邻苯三酚的吸光度值。
邻苯三酚：焦性没食子酚，没食子酚。
清除·OH韩强,林惠芬,朱玲莉. 一些天然提取物对超氧自由基和羟基自由基的清除作用[J]. 日用化学工业,2000,(3).利用邻苯三酚自氧化产生超氧自由基(O2-) , Fenton反应产生羟基自由(.OH) ;以比色法测定了一些天然提取物对这二种自由基的清除作用。
结果表明;这些取物大都具有清除作用,其中以芦丁、槲皮素、黄芪总黄酮较强。
按文献[ 12 ]的方法进行,同时参考[ 13 ]。
总体积3mL的反应液含下列试剂(以最终浓度表示):水杨酸,2. 5mmol ;乙二胺四乙酸二钠, 0. 5mmol ;FeSO4 0.5mmolH2O2, 1mmol ;KHPO4-KOH缓冲液, p H= 7. 40 ,0. 25 mol ;不同浓度的待测样品。
反应在25℃恒温水浴中进行,加入H2O引发反应,反应进行2h后,加入60μL 12mol HCl结束反应。
以6mL冷乙醚振摇萃取反应液2min ,吸取上层乙醚液4. 5mL ,于40℃水浴蒸干乙醚,然后依次加入双蒸水2mL、10 %三氯乙酸(W/ V) 0. 15mL (以0. 5mol HCl配制) 、10 %钨酸钠(W/ V ) 0. 25mL、0. 5 %亚硝酸钠(W/ V ) 0.25mL ,混匀;放置5min ,加0. 25mL 1mol KOH后,立刻于510nm处测吸光度值(A)。
样品黄芪总黄酮、芦丁、槲皮素为油溶性物质,以少量丙酮溶解供测试用, 并以等量丙酮做随行空白。
以Vit C做阳性对照物。
以下式计算各样品对·OH 的清除率(I %) :I % = [ 1 - (A Ⅲ- A Ⅳ) / (A Ⅰ- A Ⅱ) ]×100A Ⅰ:不含样品的吸光度值A Ⅱ:不含样品和H2O2的吸光度值A Ⅲ:含有样品的吸光度值A Ⅳ:含样品,但不含H2O2的吸光度值O..2清除试验韩强,林惠芬,朱玲莉. 一些天然提取物对超氧自由基和羟基自由基的清除作用[J]. 日用化学工业,2000,(3).按文献[ 9 ]的方法进行,同时参考[ 10 ] [ 11 ]。
总体积3mL的反应液含下列试剂(以最终浓度表示): Tris-HCI缓冲液,pH = 8. 20 , 50mmol ;二乙三胺五醋酸,1mmol ;邻苯三酚, 0. 2mmol ;不同浓度的待测样品。
反应在25℃恒温水浴中进行,加入邻苯三酚引发反应(邻苯三酚以10mmol HCI溶解并25℃预热),准确反应5min ,加入30μL 100mmol的DL2二巯苏糖醇(D T T)终止反应, 1h内记录325nm处的吸光度值(A)。
样品芦丁、槲皮素、黄芪总黄酮为油溶性物质,以少量甲醇溶解供测试用,并以等量甲醇做随行空白。
以抗坏血酸(Vit C)作阳性对照物。
按下式计算各样品对O÷2的清除率(I %) :I % = [ 1 - (A3- A4) / (A1- A2) ]×100A1:不含样品的吸光度值A2:不含样品和邻苯三酚的吸光度值A3:含有样品的吸光度值A4:含样品,但不含邻苯三酚的吸光度值。