第五章 细菌检验技术
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第一节 细菌形态检验技术 第二节 细菌接种与培养技术
第三节 细菌生化鉴定技术 第四节 微生物检验的自动化与微型化 第五节 细菌的其他鉴定技术
学习目标： 掌握：革兰染色的原理、操作及结果判断；细菌接种技 术 、培养方法、细菌在不同培养基中的生长现象、生化反应 的原理。 熟悉：细菌染色标本检查的基本程序，细菌培养常用培养基 和器材。 了解：细菌不染色标本的检查方法和用途；免疫学技术、分 子生物学技术及自动化检测技术等鉴定微生物。
（三）其他染色法 1. 特殊结构染色法 （3）芽孢染色法
（三）其他染色法 1. 特殊结构染色法 （4）异染颗粒染色法
Albert染色 奈瑟染色
（三）其他染色法 1. 负染色法
墨汁荚膜染色（脑脊液中的新型隐球菌，×400）
第一节 细菌形态检验技术
二、不染色标本镜检 1. 压滴法
压滴法镜 检结果： 尿涂片， ×400
★ 基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟 ★ 含糖培养基：113
℃灭菌15分钟
★ 含鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次
★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌
二、细菌接种与培养技术
（一）无菌技术 细菌检验的操作应在无菌室或生物安全柜内进行 无菌室、生物安全柜使用前后均需进行消毒灭菌 细菌检验使用过的物品使用前后需严格灭菌处理 标本的采集严格无菌操作 无菌试管、烧瓶的使用时注意管口灭菌
本章重点：★革兰染色的原理、操作方法及意义
★细菌培养及生长现象 ★细菌生化反应及临床应用
第一节 细菌形态检验技术
一、染色标本镜检 （一）染色标本检查的一般程序
（二）常用的染色方法 1. 单染色法
细菌标本经涂片、干燥固定后，滴
加染液染色1分钟，水洗后待玻片燥 后即可镜检
（二）常用的染色方法 2. 革兰染色法 【方法】
3、甲基红试验
原理：细菌发酵葡萄糖，产 生丙酮酸，进一步分解生成 大量混合酸，使培养pH下降 至4.4以下，加入甲基红后， 呈现红色反应。为甲基红试 验阳性。 方法：将待检菌种接种于葡 萄糖蛋白胨水中,35℃培养 18~24小时后,往培养基中加 入甲基红指示剂少许,观察结 果。
主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌
一、碳水化合物的代谢试验
1、糖（醇、苷）类发酵试验
原理：多糖→单糖→丙酮酸 →酸性产物(或产气) →pH↓ →呈酸性变色(或出 现气泡) 方法： 将待检细菌以无菌操 作接种到糖发酵管中，置 35℃温箱培养18～24h，观察 结果。
结 果
一、碳水化合物的代谢试验
2、 O/F试验
原理：根据细菌在分解 葡萄糖的代谢过程中对 氧分子需求的不同，将 细菌分为氧化、发酵和 产碱型三类 方法：取2支HL葡萄糖培 养管煮沸驱氧，冷却后接 种细菌。将其中一管敞开， 另一管用液体石蜡封管， 培养18 ～ 24h观察结果
（二）细菌接种与分离技术
灭菌接种环（针）—冷却—挑取标本（细菌）—接 种—灭菌接种环（针）
平板划线法
分区划线
连续划线
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
连续划线法
斜面接种
半固体穿刺接种
液体接种
（三）细菌培养方法
• 一般培养（需氧培养）：培养需氧或兼性厌氧菌 培养温度：35℃ ～ 37 ℃ 培养时间：18～24小时
• 二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱 • 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养 法、硫乙醇现象
细菌在液体培养基中生长现 细菌在半固体培养基中的现象 象
菌 膜
对 照 沉 淀 浑 浊
在穿剌线上生长 沿穿剌线扩散生长
第三节 细菌生化鉴定技术
（二）常用的染色方法 2. 革兰染色法 【结果】
紫色——革兰阳性菌（×1000）
红色——革兰阴性菌（×1000）
（二）常用的染色方法 3. 抗酸染色法 【结果】
抗酸染色结果（×1000）：红色为 抗酸杆菌，蓝色为非抗酸杆菌
（三）其他染色法 1. 特殊结构染色法 （1）荚膜染色法
（三）其他染色法 1. 特殊结构染色法 （2）鞭毛染色法
4、V-P试验
原理：细菌分解葡 萄糖产生丙酮酸， 丙酮酸脱羧生成乙 酰甲基甲醇，在碱 性环境中，乙酰甲 基甲醇被氧化为二 乙酰，二乙酰与胍 基化合物结合，生 成红色化合物，是 为V-P试验阳性。 方法：把待检细菌接种在葡萄糖蛋 白胨水中，35℃培养18~24h后，按 每毫升培养液加入0.1ml含2％肌酸 或肌酐的40％KOH溶液,数分钟或数 小时后观察结果。
培养基
液 体 培 养 基
培养基的种类（按物理性状分类） 液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯 种细菌。 半固体培养基：含0.2％～0.5％琼脂，用于观察 细菌的动力。 固体培养基：含2％～3％琼脂，用于细菌的分 离培养。
培养基制备程序 调配—溶化—调Ph—过滤澄清—分装—灭菌—检定 —保存 培养基灭菌
二、不染色标本镜检 2. 悬滴法
三、其他显微镜检查
第二节 细菌接种与培养技术
红 外 接 种 灭 菌 器
一、基本条件
一、基本条件 生物安全柜
培养箱
培养基成份 • 培养基：人工配制的适合细菌生长繁殖的综合 营养基质。 • 营养物质：牛肉膏、蛋白胨、肉浸液、糖醇类 、血液、鸡蛋及动物血清、生长因子、无机盐 等 • 水 • 凝固剂：琼脂、明胶 • 抑制剂：孔雀绿、煌绿、胆盐、抗生素等 • 指示剂：溴麝香草酚蓝，溴甲酚紫、酚红等
空白对照
阴性
结果
阳性
5、 β-半乳糖苷酶试验（ONPG）
原理：有的细 菌可产生β-半 乳糖苷酶，能 分解邻硝基酚 β-D半乳糖苷 (ONPG)而生 成黄色的邻硝 基苯酚，该试 验也称为 ONPG试验。 方法：将被检制成 菌悬液，加入1滴 甲苯充分振摇， 37℃水浴5 分钟， 使酶释放，然后再 加入0.25ml ONPG， 混匀后，置于37℃ 水浴中温育，菌悬 液呈黄色为阳性反 应。
培养基种类（按用途分） 基础培养基：普通琼脂平板 营养培养基：满足营养需求较高细菌的生长，如血 琼脂平板、巧克力琼脂平板等 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌 ，如克氏双糖铁培养基（KIA）及各种生化反应用 培养基 选择培养基：具有选择性抑制非目的菌生长作用， 用于选择性培养目的菌，如SS平板、中国蓝琼脂 平板、伊红美蓝琼脂平板等 增菌培养基：用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉 汤、GN增菌肉汤 特殊培养基：厌氧培养基、L型细菌培养基