液流系统（流动室、液流驱动系统）示意图
流动室
鞘液
进样孔
喷嘴
荧光信号
Fluorescence signals
激光束
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
（2）光学系统：激光光源、光收集系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射较长波长的光，通过较
BD LSR
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
FACSAria
科研型
特点： 分辨率高
选配多种波长和 类型激光器
可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
适用于高速分选 和多色分析
（4）分选系统
配有分选装置，分选带有某 种特性的细胞
单波长、高强度、高稳定性
多采用氩离子激光器或氦氖激光器
一般选配2~4根激光，488nm 、633nm和 355nm、407nmUV激光
最多检测13个荧光参数
光收集系统：滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，单个细胞，测量快速、大量、多参数、 准确、灵敏、定量
第一节 概 述
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧 光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分 析和分选基础上发展起来的对细胞的物 理或化学性质（如大小、内部结构、 DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速 测量并可分类收集的高技术。
第十三章 流式细胞术
流式荧光免疫技术：是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理 化特性进行多参数定量分析和纯化（对特定 群体加以分选）的现代细胞分析技术。 流式细胞仪（flow cytometry，FCM）：集 激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克 隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成（结构）
细胞功能
大小、粒度
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原
表面面积、核浆比例 细胞活性
DNA含量与细胞周期 胞内细胞因子
RNA、蛋白质含量
激素结合位点
钙离子, PH值, 膜电位 酶活性、细胞受体
一、流式细胞仪的基本结构
（1）液流系统 （2）光学系统 （3）电子数据处理系统 （4）分选系统
பைடு நூலகம்
LP 500
SP 500
BP500/50
光收集系统：光电倍增管（PMT）
FACSCalibur 光路图
（3）电子数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
FACSCalibur
特点：
光路调节系统固定
自动化程度高
操作简便
使用寿命长
配备1-2根激光
临床型（台式机）
细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
第二节 工作原理
采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 效率； 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检 测的灵敏度和特异性； 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数 信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确 性。
（一）基本工作原理
基本过程
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细 胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部 结构属性。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。
多参数，综合分析
显微镜 自然光、灯光 细胞、组织等
载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大 人工，200 简单，单参数
（二）散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细 胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
短波长的光 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光），
FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
激光光源
此为血细胞分类 的基本原理，但不能 分析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
（三）荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激 发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧 光信号区分开，送入不同的光电倍增管。
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
流式细胞仪与显微镜的区别
区别 光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
流式细胞仪 激光
细胞、生物粒子 鞘液及流动室 光学信号 PMT、放大电路 计算机，>5000
（1）液流系统：流动室、液流驱动系统
• 由样本和鞘液组成。 • 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的
单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进 入流动室形成样本流。 • 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是 包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心 位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。