9 DNA分子标记技术
9.1 基于 Southern 杂交技术的分子标记 9.2 随机（或半随机）引物分子标记技术 9.3 序列标志位点技术 9.4 分子标记的应用领域
DNA分子标记的定义
DNA分子标记就是在同一物种不同个体间 DNA序列上的差异，某一特定的差异可以通过实 验的方法检测出来，测出来的特定差异就是特定 的DNA分子标记。利用不同的实验方法可以得到 许许多多的DNA分子标记，这些DNA分子标记 表明了这些个体间遗传物质上的差异。
3. 用不同探针可以探测出不同的RFLP标记，标记 的密度远远超过以性状为基础的图谱。
RFLP 的不足
虽然RFLP分子标记有这些优点，但实验步骤 较多，费工费时，费用也高，使其应用受到一定 的限制。
要使RFLP在指导遗传育种中发挥作用，还必 须将RFLP与已知性状联系起来，仅有RFLP标记 图使用价值不大。
RFLP 分析
换不同的限制性内切酶切割，配合不同 的标记探针，可以得到数目多得惊人的条带， 从而找到很多的分子标记。这些分子标记与 表型标记一样，可以用于遗传学的研究。但 分子标记没有显隐性之分，都是共显性的。
采用一种探针 作 6 个栽培品种的RFLP分析
RFLP所用探针的来源
RFLP分析的效率依赖于选择合适的探针。 由于用能探测重复序列的探针探测出的片段太 多，难以比较，所以探针一般来自单拷贝或低 重复序列。常用的RFLP探针主要来源于随机基 因组克隆和cDNA克隆。
RFLP所用探针的来源
由于基因组DNA中甲基化一般很少在表达 基因中发生，故用对甲基化敏感的限制酶切， 可得到长度为1～2kb的DNA片段，它 用 cDNA 克 隆 作 探 针 ， 最 好 制
RAPD （ randomly amplified polymorphic DNA）称为随机扩增DNA多态性。它是利用随 机引物（通常为10个核苷酸）对不同生物个体基 因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离， 溴化乙锭染色，显示出扩增产物的多态性。不同 个体间差异的条带可以作为分子标记。
MAAP技术比较
(Multiple arbitrary amplicon profiling)
AP-PCR：arbitrarily primed polymerase chain reaction
遗传标记的发展
形态标记→ 细胞学标记（染色体多态性）→ 蛋白质标记（同工酶，分子标记）→ DNA 标记（分子标记）
RFLP 分析
RFLP （ restriction fragment length polymorphism）称为限制性片段长度多态性。当用 某种限制性内切酶处理不同生物个体来源的DNA 时，由于个体间DNA序列的差异，所产生的切割 片段长度和数量可能不同，利用凝胶电泳可以将 这些片段分离并观察到差异，这种差异就是 RFLP。
RFLP
标 记 的 共 显 性
什么是多态性
多态性是在不同个体之间比较得到 的差异带，来自于一个个体本身的长短 不等的片段不是多态性。
RFLP 标记的优点
1. RFLP标记无表型效应，不受环境条件和发育阶 段的影响。因此可在特征性状远未出现之前就可 以知道其基因型。
2. RFLP标记在等位之间是共显性的，因此不受杂 交方式的影响。不管是正交、反交、回交，总是 在F1代中含有两亲本各一组染色体的片段之和。
VNTR差异带的检测
父
的 检 测 结
母 子 女 间
VNTR
果
VNTR应用举例
用33.15（探针名）进行白种人的DNA指纹分 析时，两个无血缘关系的个体具有相同DNA指纹 图谱的概率为3×10－11，而当把33.15和33.6两个 探针取得的结果综合分析时，两个个体指纹图谱 相同的概率更是降低到5×10－19。
可变数量串联重复（VNTRs）
在真核生物基因组中有小卫星和微卫星序列存 在，它们是短序列（核心序列）高度重复的序列， 在不同生物个体间，某一座位上的核心序列重复的 次数有很大差异，并且这些重复序列有多座位性， 因此形成了高度的多态性。用某种高度重复序列的 核心序列作探针，测定其RFLP，得到电泳后的杂交 图谱，这种图谱称为指纹图谱，可以用来鉴别个体、 亲子鉴定等。
RFLP 分析
RFLP产生的差异带可以作为分子标记，用于 遗传学的研究。
当 一 个 生 物 有 多 条 染 色 体 ， 且 DNA 分 子 很 大 时，用一种限制性内切酶切割出的DNA片段太多， 电泳后的条带无法分辨。
使用某一特定序列的标记探针，与电泳分离的 片段进行Southern杂交，再显示出杂交带，可以大 大减少被观察条带的数目，便于不同生物个体间的 比较和找出差异带。
VNTRபைடு நூலகம்例
The cause of the variation between individual genomes at microsatellites or minisatellites is that individual alleles have different numbers of the repeating unit.
两个不同油菜品系的RAPD
RAPD的特点
➢虽然对具体的一个引物而言其检测DNA多态性的位 点是有限的，但是当采用一组引物时，检测区域几乎 可以覆盖整个基因组，从而得到整个基因组DNA的多 态性。
➢RAPD的特点是操作简便迅速，不需要标记探针。只 要有一套随机引物就能对任何物种进行RAPD操作。
➢RAPD标记也必须与表型相联系才能发挥指导遗传育 种的作用。
For example, one minisatellite has a repeat length of 64 bp, and is found in the population with the following distribution:
7% 18 repeats 11% 16 repeats 43% 14 repeats 36% 13 repeats 4% 10 repeats