三联吡啶钌（ [Ru(bpy)3]2+ ）特点
[Ru(bpy)3]2+衍生物与免疫球蛋白结合的分 子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免 疫活性； [Ru(bpy)3]2+分子量小，空间位阻小 ，即便 小分子的核酸也能标记，使检测的菜单大 大丰富，更重要的是为其检测菜单的开发 前景提供了广阔空间。
化学发光分析优点
化学发光具有荧光的特异性，同时不需要 激发光，就避免了荧光分析中激发光杂散 光的影响有很高的灵敏度， 并且不象放射分析那样存在强烈的环境污 染和健康危害，是一种非常优秀的定量分 析方法。
化学发光分析缺点
虽然化学发光具备很高的特异性和很 小的干扰，但化学分析本身的不特异 性，制约了整个方法的使用。
临床应用
激素 肿瘤标记物 内分泌功能 传染性疾病 其它

如VB12、叶酸、铁蛋白、肌钙蛋白、肌红蛋白、酶、 脂肪酸、维生素和药物等多种检测项目。
化学ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ光免疫分析
化学发光免疫分析（ CLIA）分类
按分离方法不同分

微粒子化学发光免疫测定 磁颗粒化学发光免疫测定
化学发光免疫分析（ CLIA）分类
按发光剂不同分为



发光酶免疫测定（chemiluminescence enzyme immunoasssay， CLEIA ） 化学发光免疫测定技术 （chemiluminescence immunoassay， CLIA ） 电化学发光免疫测定技术（electro－ chemiluminescence immunoassay， ECLI ）
化学发光是指在某些特殊的化学反应中， 反应的中间体或产物由于吸收了反应释 放的化学能而处于电子激发态，当其回 到基态时伴随产生的光辐射现象。
化学发光 反应包括 两个关键 步骤，即 化学激发 和发光。
化学发光反应能级图
化学发光分析
根据化学发光反应在某一时刻的发光强 度或反应的发光总量来确定反应中相应 组分含量的分析方法，称为化学发光分 析。
电化学发光免疫分析法
Electro-Chemiluminescence Immunoassay (ECLI )
免疫分析法 发光和化学发光 化学发光免疫分析法 电化学发光 电化学发光免疫分析法
免疫分析
基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的 一种手段； 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高 度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体 分子上，通过这些标记物的增强放大效应 来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含 量。
免疫学检测历史演进
放射免疫检测（兴起于20世纪70年代，现 仍普遍使用于县级以上医院）； 酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代，各 临床机构普遍使用）； 以化学发光为代表的光生物学标记及免疫 检测技术（20世纪90年代开始推广使用， 产品步入成长期）三个阶段。
免疫分析法 发光和化学发光 化学发光免疫分析法 电化学发光 电化学发光免疫分析法
免疫分析法 发光和化学发光 化学发光免疫分析法 电化学发光 电化学发光免疫分析法
电致化学发光（ECL)
电致化学发光 (ECL) 是通过在电极上施 加一定波形的电压或电流信号进行电解 反应的产物之间或与体系中共存组分反 应产生化学发光的现象。
电致化学发光（ECL)
ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光 反应，而CL是通过化合物混合启动发光 反应。因此ECL反应易精确控制，具有 灵活性。
电化学发光原理图
TPA TPA
3+ R u ( b py ) 3
+●
●
激发态
Ru(bpy) 3 R u ( b p y )32 +
基态
不稳定
*
光 子( 6 2 0 n m )
免疫分析法 发光和化学发光 化学发光免疫分析法 电化学发光 电化学发光免疫分析法
(Electro-Chemiluminescence Immunoassay, ECLI)
方法评价
采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8 μm的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积 比板式扩大20－30倍，吸附效率高；在 液体中形成均匀的悬液，参与反应时类 似液相，反应速度大大加快；
方法评价
“链霉亲和素-生物素”是是具有很强的非 共价相互作用的一对化合物，具有牢固而 特异的结合，应用此放大系统，使检测的 灵敏度大大提高；
方法评价
利用氧化铁的磁性，使用电磁场分离结 合态和游离态，方便迅速，实现了精确 的全自动化； 标记物的再循环利用，使发光时间更长、 强度更高、易于测定。
ELIA优越性
高度敏感，可达pg／ml或pmol水平； 特异性强，重复性好，CV＜5％。 测定范围宽，可达7个数量级。 试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长， 达数月甚至数年。 操作简单，耗时短，易于自动化。 在对环保很重视的国家，CLIA成了取代 RIA的首选方法。
发光现象
萤火虫发光
深海鱼发光
发光分类
光照发光:发光剂经短波长入射光照射后 进入激发态，当回复至基态时发出较长 波长的可见光。
生物发光：反应底物在荧光素酶的 催化下利用ATP产能，生成激发态 的氧化荧光素，后者在回复到基态 时多余的能量以光子形式放出。 化学发光
化学发光 Chemiluminescence (CL)
ECLI是继EIA、RIA、FIA、时间分辨 荧光免疫技术（TRFIA）之后的新一 代标记免疫测定技术； ECLI是电化学发光(ECL)和免疫测定相结 合的产物； ECLI是目前最先进的标记免疫测定技术 之一。
电化学发光免疫分析
ECLI原理
在电极表面由电化学引发的特异性化学发 光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]2+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁 珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发 出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定 性。
免疫分析法 发光和化学发光 化学发光免疫分析法 电化学发光 电化学发光免疫分析法
chemiluminescence immunoassay （ CLIA）
CLIA是将化学发光分析和免疫反应相结 合而建立的一种新的免疫分析技术。 这种方法兼有发光分析的高灵敏度和抗 原抗体反应的高度特异性。
电化学发光剂
定义：指通过在电极表面进行电化学反应 而发出光的物质。 特点


反应在电极进行 化学发光剂：三联毗啶钌 电子供体为：三丙胺（TPA）
三联毗啶钌分子结构图
O O N N Ru N N N N O O N
三联吡啶钌 （ [Ru(bpy)3]2+ ）特点
ECL分析中采用[Ru(bpy)3]2+作为标记物， 其活化衍生物是[Ru(bpy)3]2+＋N羟基琥珀 酸胺酯（NHS） ，该衍生物具有水溶性， 且高度稳定，保证电化学发光反应的高效 和稳定，而且避免了本底噪声的干扰。