北京索莱宝科技有限公司
活性氧检测试剂盒 Reactive oxygen species assay kit
货号：CA1410
规格：100-500T
产品内容：
10 mM DCFH-DA in DMSO 活性氧供体 说明书
0.1 ml 1 ml 1份
20 ºC 保存 20 ºC 保存
产品简介：
活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化
物(O2•−, H2O2, •OH, ONOO−, •NO)等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过
程。采用 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)是迄今常用也是较灵敏的细胞内活性氧检探针。
DCFH-DA 没有荧光，进入细胞后被酯酶水解为 dichlorofluorescin (DCFH)。在活性氧存在时 DCFH 被氧化
3. PBS 洗涤细胞 2 次。 三、荧光检测
采用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜图像检测照相，绿色荧光强度代表活性氧水平。也可进行微板荧 光分析仪(multiwell fluorescence plate reader)实时或每 10 分钟分时逐点检测荧光强弱。对于流式细 胞仪可将细胞用胰酶消化 PBS 洗涤后重悬检测。
1. 加入 DCFH-DA 于培养基，推荐初始工作浓度为 10 µM。对不同的细胞和处理，DCFH-DA 工作浓度可 为 100 nM~20 µM，需进行预实验确定合适的浓度。总体稀释倍数应在 1:500~1000 以上以避免 DMSO 对细胞 的影响。以 DMSO 作为溶剂对照。
2. 37 ºC 孵育细胞 30min~至几个小时，通常 30-60min 即可。孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、 DCFH-DA 浓度有关。
仪定量 ROS 检测。
工作波长： 最佳激发波长 500、485 (500 15 nm)，最佳发射波长 525 (530 20 nm)。也可按照 FITC 荧光检测
条件检测。
操作步骤： 一、试剂准备：
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1. DCFH-DA 可稀释于培养基或缓冲液中。血清或培养基颜色并不影响 DCFH-DA 及细胞内荧光产生，但 可能会影响荧光显微镜观察，干扰荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪荧光测定。可将 DCFH-DA 稀 释于无酚红培养基或适宜的缓冲液如 PBS 中。这依赖于使用何种荧光设备进行测定。
2. 加入 DCFH-DA 的时机或孵育时间，以最终能顺利检测细胞内活性氧为目的。药物处理时间较短(<2 小时)或预计 ROS 效应较弱，可先加或同时加入 DCFH-DA。反之，treat 刺激时间较长(>6 小时)或预计产生 ROS 效应较强，可后加 DCFH-DA。
3. 活性氧供体含高纯度 12 mM H2O2。加入细胞后其本身即是一种活性氧，而且在代谢过程中可产生其 它类型的活性氧，均可使 DCFH-DA 氧化为 DCF 呈现强绿色荧光。因而，用户可使用该试剂作为测试实验系 统或仪器的阳性试剂，以初步观察细胞活性氧所产生的荧光的一般特征，并且也可以将该实际作为实验的 一个阳性对照。推荐该试剂的细胞工作浓度为 20~100 µM 或更低浓度，但超过 200µM 将产生细胞毒。如果 用户熟悉 ROS 荧光或实验没有必要采用阳性对照，可以不加该试剂。 二、加入荧光探针：
为不能透过细胞膜的强绿色荧光物质 dichlorofluorescein (DCF)，其荧光在激发波长 502 nm，发射波长
530 nm 附近有最大波峰，强度与细胞内活性氧水平成正比。此活性氧检测系统本底低，灵敏度高，激光共聚焦显微镜等图像检测，荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞
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