① 识别特定的核苷酸序列；② 在识别序列内或者识别 序列的相邻位置具有特定的切割位点；③ 没有甲基化 修饰酶功能，不需要ATP和SAM 等辅助因子
识别序列： GAATTC 切割位点
G AA T T C C T T AA G
切割位点 切割后 G CTTAA AATTC G
EcorR I 对DNA链的 切割效果及识别序列 的双轴对称性
H2N
C O
CH2
CH NH2
COOH
H2N
C O
CH2 CH2
CH NH2
COOH
天冬酰胺，Asparagine (N), アスパラギン, AAC / AAU
谷酰胺，Glutamine (Gln, Q), グルタミン, CAA / CAG
HO
CH2
CH NH2
COOH
N H
CH2
CH NH2
COOH
3. 遗传信息的传递方向
4. 基因的表达与调控
5'
GC AT AT AT GC T A
3'
G
C
AT GC
TA CG
AT GC
C G
AT
Replication Directions
GC
TA CG
AT GC
5'
3'
5'
3'
DNA
RNA 翻译
蛋白质
遗传信息的传递规则 — 中心法则
GENE
启动子 转录区 终止子
tRNA介导定点参入非天然氨基酸
重组蛋白质的表达 1、重组蛋白质在大肠杆菌中的表达
3. 平端DNA片段的连接
识别序列：GAATTC
切割位点
G AA T T C C T T AA G
切割位点
EcorR I 对DNA 链切割后产生的 粘性末端
切割后
G CTTAA AATTC G
识别序列：GTTAAC
切割位点
G T T AA C
C AA T T G
切割位点
Hpa I 对DNA链切割 后产生的平末端
基于天然蛋白 质结构的设计 蛋白质的 结构基础 蛋白质的 分子设计 蛋白质的 修饰表达
化学修饰 的途径 性质分析 结构测定 分子生物 学的途径 突变蛋白 质的应用
全 新 蛋 白 质 的 设 计
蛋 白 质 工 程 的 内 容 及 实 施 工 程
蛋 白 质 工 程 修 饰 和 表 达 1. 蛋白质修饰的化学途径 2. 蛋白质修饰的分子生物学途径
3. 其他限制性取代
蛋白质片段的嵌合修饰
1. 基于非共价缔合的嵌合蛋白质 2. 基于化学激活型肽键的嵌合蛋白质
3. 基于二硫键的嵌合蛋白质
4. 基于酶连接反应型肽键的嵌合蛋白质 5. 别型的嵌合蛋白质
疏
CH3 CH NH2 COOH
水
CH2 NH2
氨
基
酸
CH3 CH CH3 NH2 CH COOH
骼氨酸，Tyrosine (Y), チロシン UAC / UAU。侧链含酚基
色氨酸 ，Tryptophan (W), トリプトファン, UGG。 侧链含吲哚基
蛋白质修饰改造的途径
1. 化学途径
2. 分子生物学途径 把以重组DNA技术为核心的基因工程作 为手段，来定向地改造天然蛋白质的技 术途径。
蛋白质修饰改造的分子生物学途径 1.基因工程的概述 （1）基因工程的诞生 （2）基因工程的理论基础 （3）基因工程的概念和内容 （4）基因工程的工具酶和载体 （5）基因工程的过程 2.利用基因工程技术定向改造蛋白质的类型 （1）基因的专一性位点突变 （2）基因的区域性定向突变 （3）基因融合和基因剪接 （4）tRNA介导定点参入非天然氨基酸
3. 基于抗生素抗性恢复的突变法
4. 基于去除特定限制酶切位点的突变法
基因的区域性定向突变 盒式突变法（Cassette mutagenesis）: 利用目标基因中具有的适当的限制性酶切位点， 用具有任何长度、任何序列的DNA片断来置换或者取 代目标基因上的一段DNA序列。
基因融合和基因剪接 1. 利用PCR双链重叠延伸法的基因融合和基因剪接 2.利用PCR单链重叠延伸法的基因融合
3. 分子生物学途径所修饰蛋白质的表达
O
H N Arg Pro Val Boc
O Thrombin
NH2 + Arg Pro Val Boc Me
Me
Intensity
Wavelength (nm)
Fluorescent sensing of thrombin-catalysed cleavage reaction of bocval-pro-arg-7-amido- 4-methylcoumarin (AMC), monitored by UVspectrum measurement
COOH 赖氨酸，Lysine (Lys, K), リジン
AAA / AAG
HC N C H
C NH
CH2
CH NH2
COOH
组氨酸，Histidine (His, H), ヒスチジン CAC / CAU。侧链含咪唑基
极性中性氨基酸
HO CH2 CH NH2 COOH
CH3
CH OH
CH NH2
COOH
基因的专一性位点突变
1.普遍使用的DNA快速扩增技术—PCR反应
2.影响专一性位点突变的因素
3.几种专一性位点突变
（1）Kunkel突变法
（2）利用PCR的突变法 （3）基于抗生素抗性恢复的突变法 （4）基于去除特定限制酶切位点的突变法
变性
引物 5' 3' 延伸 引物 5' 3'
退火
DNA快速扩增技术
切割后
GTT CAA AAC TTG
Hind III AmPr
BamH I
Hind III
BamH I
Hind III
Tetr AmPr
切割后
X
切割后
Tetr
Y
X
Y
Y
X
连接后
AmPr
外源DNA片断 的定向克隆
Tetr
重组DNA的转移 1.受体细胞
也称为宿主细胞或基因表达系统。受体细胞为
目的基因的复制、转录、转录后加工、翻译、 翻译后加工及分泌等提供了条件，以便实现目 的基因的表达。 2. 重组DNA分子导入受体细胞 (1)转化（CaCl转化法）；(2)转导；(3)显微注射 (4)高压电穿孔；(5) 其它的导入法。
脯氨酸，Proline (P), プロリン CCA / CCC / CCG / CCU
苯丙氨酸，Phenylalanine (F), フェニルアラニン，UUC / UUU
极性酸性氨基酸
HOOC CH2 CH NH2
天冬氨酸，Aspartic acid (D), アスパラギン酸 GAC / GAU
COOH
引物
3' 5'
PCR反应
引物
3' 5'
循环
影响专一性位点突变的因素 1. DNA模板的制备 2. 寡聚核苷酸突变引物的设计和选择
3. 引物的延伸条件
4. DNA聚合酶的选择
5. dUTP对DNA合成反应的影响
6. 受体细胞对突变体产率的影响
几种专一性位点突变
1. Kunkel突变法
2. 利用PCR的突变法
2. 分类：根据不同分类也不同 (1) 质粒载体、噬菌体载体、病毒 载体、人工组合载体 (2) 克隆载体 、表达载体
(3) 原核细胞表达载体；真核细胞表达载体
基因工程的概念及内容 1. 基因工程的概念
也叫遗传工程，是将外源基因通过体外重组导入 受体细胞，使其在受体内复制、转录、翻译表达 的操作过程。 2. 基因工程的内容 ① 目的基因的分离; ② 重组DNA的制作; ③重组 DNA的转移; ④受体中重组体的筛选; ⑤目的基因 在重组体中的表达; ⑤基因产物的检出 · 分离
CH2
CH
COOH
CH3 CH2
CH CH3
CH NH2
COOH
异亮氨酸，Iloleucine (I), イソロイシン AUA / AUC / AUU
H2 H2 N H H2 H COOH
CH2 CH NH2 COOH
CH3
S
CH2 CH2
CH NH2
COOH
蛋氨酸，Methionine (M), メチオニン，AUG。侧链含甲硫基
蛋白质修饰的化学途径
1. 功能基团的特异性修饰 2. 蛋白质片段的嵌合修饰
功能基团的特异性修饰 1. 多位点取代
2. 限制性取代
3. 次级取代
多位点取代
1. 氨基保护
2. 亚氨代乙酰化 3. 羧基的甲基酯化
4. 巯基的氧化
限制性取代 1. 蛋白质水解酶的限制性取代
2. α异硫氰酸苯酯的限制性取代
② 用于真核生物宿主的载体来自DNA限制性内切酶 1. 内切酶的定义 从细菌或噬菌体中发现的能识别和切断双链DNA分子子内 特殊核苷酸序列的酶。 2. 内切酶的分类： I 类、II类、III类 (1) I 类和III类限制性内切酶的特点： 识别特定的核苷酸序列位点, 没有特定的切割位点 (2) II类限制性内切酶的特点：
G
A
A
T
T
C
3¹ OH
T T
5¹
HOPHO3 O3HPOH A A 5¹ 退火 HO 3¹
C
G
G 3¹ O
5¹ A PHO3
A
T
T
C
O3HP C T T A A 5¹
O 3¹ G
T4DNA连接酶对DNA片断的作用原理