第２７卷第１期
Ｖ０１．２７ Ｎｏ．１
分析科学学报
ＪＯＵＲＮＡＩ。（）Ｆ ＡＮＡＩ。ＹＴＩ（、ＡＩ，Ｓ（、ＩＥＮＣＥ
２０１１年２月
Ｆｅｂ． ２０１ １
文章编号：１００６—６１４４（２０１１）ｏｌ—００２ｌ—０５
高效液相色谱一荧光检测法同时测定人体尿液中的
多种蝶呤类化合西南昌３３００４７） 摘要：建立了高效液相色谱一荧光检测法同时测定人体尿液中的蝶呤、新蝶呤、生物蝶 呤和墨蝶呤。尿液在酸性条件下经碘一碘化钾溶液氧化３０ ｍｉｎ，滴加抗坏血酸还原液 后，可进行液相色谱分析。色谱柱为Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８柱，用体积比９：１０的水一甲醇为流动
第２７卷
蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤标准品均购自于美国Ｓｉｇｍａ公司；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均
为分析纯；水为超纯水。 １．２标准溶液的配制
准确称取适量的蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤的标准品分别置于４个２５ ｍＩ。的棕色容量瓶中，加 数滴１．Ｏ ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ（）Ｈ溶液溶解，用超纯水稀释至刻度，摇匀，配成浓度分别是：蝶呤８４．８＂ｇ／ｍＩ。、新蝶 呤９０．Ｏ ｐｇ／ｍＩ。、生物蝶呤８０．Ｏ ｐｇ／ｍＬ和墨蝶呤７４．Ｏ ｐｇ／ｍＬ的标准储备液，置于冰箱内４℃保存，使用
１．４色谱条件
Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ
Ｃ，。色谱柱（２５０×４．６ ｍｍ，５弘ｍ）；柱温为室温；流动相：水一甲醇一９０：１０（Ｖ／Ｖ）；流速为１．ｏ
ｎｍ，Ａ。＝４４５ ｎｍ。
ｍＬ／ｍｉｎ；进样量为１０“Ｌ；荧光检测波长为Ａ。。＝３６０
２结果与讨论
２．１流动相的组成及流速的选择
分别采用甲醇一水、乙腈一水、甲醇一磷酸盐缓冲溶 液（ｐＨ＝６．５６，７．０，７．４３）作流动相，考察了不同流 动相配比及流速对四种蝶呤类化合物色谱分离行为 的影响。结果表明：乙腈一水体系作流动相时，墨蝶 呤的荧光响应强度不高，且四种蝶呤类化合物的保 留时间过小，尿液中的共存物质对其检测干扰较大； 甲醇一磷酸盐缓冲溶液（ｐＨ＝６．５６，７．Ｏ，７．４３）作流 动相时，生物蝶呤和蝶呤的分离效果不够理想；甲 醇一水体系作流动相且当甲醇：水一ｌＯ：９０（Ｖ／Ｖ），流
ｍＬ、Ｏ．００２ ｐｇ／ｍＬ、Ｏ．００１弘ｇ／ｍＬ和Ｏ．１５ ｐｇ／ｍＬ。
２．３样品前处理方法的选择
人体尿液成分复杂，为保证分析结果的准确性，考察了以下三种样品前处理方法：（１）取晨尿１．ｏ
ｍＬ，
经０．４５肛ｍ的微孔滤膜过滤，定容至５ ｍＬ容量瓶中，待测。（２）取晨尿１．ｏ ｍＬ置于５ ｍＩ。塑料离心管
ｓ棚ｐｌ器ｆｒｏｍ啪ｃｅｒ
ｐａｔｉｅｎｔｓ（一＝６）
Ｓａｍｐｌｅ
Ｎｅｏｐｔｅｒｉｎ
Ｂｉｏｐｔｅｒｉｎ
Ｐｔｅｒｉｎ
Ｓｅｐｉａｐｔｅｒｉｎ
（弘ｇ／ｍＬ）
３ Ｏ１ ５
Ｏ
（“ｇ／ｍＬ）
３ ４４７ Ｏ ２４ １
０
（“ｇ／ｍＬ）
Ｏ ４７２ Ｏ ４３
Ｏ
ｏｏ
（ｐｇ／ｍＬ）
ＮＤ ＮＤ ＮＤ ＮＤ ＮＤ ＮＤ
ｉ
万方数据
１．Ｎｅｏｐｔｅｒｉｎ（Ｏ．１ （Ｏ．１
ｐｇ／ｍＩ，）；４．Ｓｅｐｉａｐｔｅｒｉｎ（１．５ ｐｇ／ｍＩ。）．
蝶呤的色谱分离效果较好，荧光响应强度较高，分析 时间较短，尿液中共存物质对其测定无影响且系统压力不高。四种蝶呤类化合物的色谱图见图１。
２．２标准曲线与检出限
取适量的标准储备液，分别配制一系列不同浓度的标准工作液，按选定的色谱分离条件进行分析，并 以峰面积对浓度作图。结果表明：新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和墨蝶呤的含量分别在Ｏ．００５～１．５肛ｇ／ｍＬ、
ｌｉｐｏｒｅ公司）。
收稿日期：２０１０一０６一０８ 修回日期：２０１０—０９一０２
基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ．２０７６５００２）；江西省自然科学基金（Ｎｏ．０６２００４９）
。通讯作者：万益群，男，教授，博士研究生导师，研究方向：生命化学及色谱分析．
２１
万方数据
第１期
崔盼盼等：高效液相色谱一荧光检测法同时测定人体尿液中的多种蝶呤类化合物
１．Ｏ
ｍｏｌ／Ｌ的盐酸和５ｍｇ二氧化锰，摇匀，于暗处放置３０
ｍｉｎ，取上清液振荡１０ 瓶中，待测。
ｒ／ｍｉｎ下离心１０ ｍｉｎ，经ｏ．４５肛ｍ的微孑Ｌ滤膜过滤，定容至５ ｍＬ容量
将上述三种方法处理得到的空白尿样及添加蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤标准溶液的尿样按选定
２２
万方数据
第１期
分析科学学报
第２７巷
实验部分
１．１仪器与试剂 Ａｇｉｌｅｎｔｌｌｏｏ高效液相色谱仪（美国，Ａｇｉｌｅｎｔ公司），配荧光检测器，Ａｇｉｌｅｎｔ液相色谱工作站；ＫＱ－ ５０ＤＢ数控超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；ＴＤＬ一５一Ａ型低速台式离心机（上海安亭科学仪 器厂）；ＭＳ２型迷你振荡器（广州仪科实验室技术有限公司）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＿Ｑ Ｇｒａｄｉｅｎｔ超纯水装置（美国，Ｍｉ卜
表５健康人尿样加标回收（ｎ＝５）
ＴａｂＩｅ ５ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｕｒｉｎｅ ｓａｍｐｌｅ
Ｏ．０５～２．０肛ｇ／ｍＬ、ｏ．０１～１．ｏ ｐｇ／ｍＬ和Ｏ．３～１０．ｏ ｐｇ／ｍＬ范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，其 线性回归方程分别是：ｙ一２１７．５ｌｚ一１．１２７（ｒ＝０．９９９０）；ｙ一３１３．４３ｚ＋１２．６２２（ｒ—ｏ．９９８２）；ｖ一５１７．６１ｚ
＋２．２６５９（ｒ—ｏ．９９９５）；ｙ一５．１６１８ｚ—ｏ．１４４７（，．＝ｏ．９９９８）；以三倍信噪比计算，检出限依次是：ｏ．００３“ｇ／
中，加６．ｏ ｍｏｌ／Ｉ。的盐酸１～２滴，加ｏ．０５ ｍｏｌ／Ｌ碘一碘化钾氧化液１．ｏ ｍＬ，于暗处放置３０ ｍｉｎ，滴加ｏ．０５
ｍｏｌ／Ｌ抗坏血酸还原液１．ｏ ｍＬ，摇匀，加水至５ ｍＩ。，经Ｏ．４５弘ｍ的微孔滤膜过滤得进样液。（３）取晨尿
１．ｏ
ｍＩ。置于５ ｍＬ塑料离心管中，加入Ｏ．１ ｍＬ
ｍｉｎ，１２ ０００
中图分类号：０６５７．７＋２ 文献标识码：Ａ
蝶呤类化合物（Ｐｔｅｒｉｄｉｎｅｓ）在生物体代谢过程中起重要的辅助作用，可作为体内“淋巴细胞一巨噬细胞 轴”所介导的细胞免疫防御系统激活程度的标志物，体液中其水平的高低反映了体内细胞免疫状态，已用 于多种疾病的监测Ⅲ。主要的几种蝶呤类化合物包括蝶呤（Ｐｔｅｒｉｎ）、新蝶呤（Ｎｅｏｐｔｅｒｉｎ）、黄蝶呤（Ｘａｎ— ｔｈｏｐｔｅｒｉｎ）、异黄蝶呤（Ｉｓｏｘａｎｔｈｏｐｔｅｒｉｎ）、蝶呤一６一羧酸（Ｐｔｅｒｉｎ一６一ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、生物蝶呤（Ｂｉｏｐｔｅｒｉｎ）和墨 蝶呤（Ｓｅｐｉａｐｔｅｒｉｎ）等。其中，以新蝶呤的研究最为广泛，已应用于临床上多种类型疾病的诊疗∞４］，其它蝶 呤类化合物相对研究较少¨柚］。墨蝶呤是蝶呤类化合物的一种，目前主要研究对象为动物细胞及人体脑 脊液，对人体尿液中墨蝶呤含量检测的研究鲜有报道。 本文系统探讨了人体尿液中蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤的色谱分离条件，同时考察了尿液的前 处理方法，在此基础上，建立了四种蝶呤类化合物同时分析的新方法，并应用于健康人、普通病人和癌症病 人尿样检测，取得了较好的效果。 １
速为１．Ｏ ｍＬ／ｍｉｎ时，新蝶呤、蝶呤、生物蝶呤和墨
三．
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三
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１５
２０
２５
３０
Ｔｉｍｅ／ｍｉｎ
图ｌ
Ｆｉｇ．１
四种蝶呤类化合物的色谱分离图
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｆｏｕｒ ｐｔｅｒｉｄｉｎ器 ｐｇ／ｍＬ）；２．Ｂｉｏｐｔｅｒｉｎ（Ｏ．１肛ｇ／ｍＬ）；３．Ｐｔｅｒｉｎ
弘ｇ／ｍＬ和０．１５弘ｇ／ｍＬ。加标平均回收率在８４．８％～１２０．ｏ％之间。用该方法测定了 健康人、普通病人和癌症病人尿样中的蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤，发现癌症病人 尿样中的新蝶呤水平与健康人和普通病人相比有所升高，生物蝶呤水平有所降低。该 方法准确，可行，适用于临床上尿样中蝶吟类化合物的检测。 关键词：蝶呤类化合物；人体尿液；高效液相色谱；荧光检测
５ ６ ７
ＯＯ６
Ｏ Ｏ １１
Ｏ
Ｏ Ｏ７ １ Ｏ Ｏ １５ Ｏ ＯＯ５ Ｏ Ｏ２ ８
３ ２９ Ｏ Ｏ ３ ８７ ３ ５７１ ３
４
Ｏ ４３ ６
Ｏ
ＯＯ９
Ｏ １６
２ ６Ｏ
Ｏ Ｏ ５６
Ｏ Ｏ
Ｏ５
Ｏ●
ｌ８ ｌ９ ２０ ａ：ｊ±ｓ；ｂ：ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．
Ｏ Ｏ３ ９
Ｏ ９２７ Ｏ ６ ５ ４ ＋一士±土士
所降低。
表ｌ健康人尿样的分析结果（疗＝６）
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ａｎａＩｙｔｉｃａＩ Ｉ‘ｅｓｕＩｔｓ ｏｆ ｕｒｉｎｅ ｓａｍｐＩｅｓ
ｆｒ咖ｈｅａｌｔｈｙ ｐｅｏｐｌｅ（ｎ＝＝６）
９ １０ １１ １２ １３ １４
Ｏ．４２８±Ｏ．０２３ ２．５５９士Ｏ．０７２ ２．０５０±Ｏ．０５７ ２．５７０士Ｏ．０１４ Ｏ．３９９士Ｏ．０５０ ３．４９ｌ士Ｏ．０１６
第２７卷
ＩｎｆＯｍａｔｉ伽０ｆ
Ｓｅｘ
Ｏｒｄｉｎａｒｙ ｐａｔｉｅｎ协ａｎｄ ＳａｍｐＩｅ １５ １６ １７ １８ １９ ２０
ｃａｎｃｅｒ
ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｓｅｘ ｍａｌｅ ｍａｌｅ ｍａｌｅ ｍａｌｅ ｍａｌｅ ｆｅｍａｌｅ Ａｇｅ ４８ ６５ ７６ ５３ ６３ ５９
Ａｇｅ ７９ ６９ ８ ２４ ３４ ２２
Ｏ．０１８±Ｏ．０１０ １．５１９±Ｏ．０２６ １．６５６ ２．３７５±Ｏ．０２１ Ｏ．１１４±Ｏ．００５ １．０５９士Ｏ．０２７
Ｏ．２６１±Ｏ．００６ Ｏ．６７９土Ｏ．０５９ ＮＤ ＮＤ Ｏ．０８２ Ｏ．６１４±Ｏ．００８
ＮＤ ＮＤ ＮＤ ＮＤ ＮＤ ＮＤ
表３癌症病人尿样的分析结果（捍＝６）