扬州大学《现代分子生物学》5分子 生物学研究方法
•5.2 常见的DNA操作技术
常用的转化方法：
§ 化学转化（CaCl2）法 § 电击法
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•5.2 常见的DNA操作技术
化学转化原理：
在0℃冷冻处理时，处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆 菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的 热冲击下，细胞吸收外源DNA ，然后在丰富培养基内 复原并增殖，表达外源基因。
出每微克的转化菌落数）
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•5.2 常见的DNA操作技术
5.2.2 聚合酶链式反应（PCR）技术
§ 1985年，K.Mullis等研究成功的一种在体外快 速扩增特定基因DNA序列的方法
§ 原理：类似于天然的DNA复制过程。将待扩 增的DNA片段和两侧互补的两段寡核苷酸引 物，经过变性，退火和延伸若干个循环后， DNA扩增倍数可达2n 倍
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•5.2 常见的DNA操作技术
反应体系
§ 模板DNA：待扩增的目的片段 § 特异性引物：人工合成的与待扩增的靶DNA两端序
列互补的寡核苷酸片段，15-30bp § DNA聚合酶 § dNTP § 含有Mg2+的缓冲液
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•5.1 重组DNA技术发展史
•5.1.3重组DNA技术的概念
▪ 重组DNA技术(recombinant DNA technique): 是 按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁 殖，以获得该DNA的大量拷贝。
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•5.1 重组DNA技术发展史
•2、重组DNA技术的基本步骤
▪ ①目的基因的获得与载体的制备 ▪ ②目的基因与载体DNA的连接 ▪ ③重组DNA分子导入受体细胞 ▪ ④重组体的筛选与重组DNA的鉴定 ▪ ⑤克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化
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▪ 1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化 钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国 斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞 也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA 技术的创立具有特别重要的意义。
▪ 3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应
四环素、链霉素等 § -互补蓝白斑筛选 § 营养条件（自养、异养）
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•5.2 常见的DNA操作技术
-互补筛选
§ β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基
端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒 § 编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的
从DNA链的5’末端逐个切除单核苷酸
切除位于DNA链5’或3’末端的磷酸基团
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•5.1、 重组DNA技术发展史
•限制性核酸内切酶
•限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
•一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核 酸水解酶
•将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞 获得新的遗传性状
•转导？ 转染？
•感受态细胞（Competent cells） ： •受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化 学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变 化，能容许有外源DNA的载体分子通过，处于 这种状态下的细胞称~
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•5.2 常见的DNA操作技术
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•5.2 常见的DNA操作技术
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•P153
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•5.2 常见的DNA操作技术
电击转化：
•Bam HⅠ
•GGATC
C •GCCTAG
••GCCTAG•+••GATCGC
•分类:
•Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
•（基因工程技术中常用Ⅱ型）
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•5.1 重组DNA技术发展史
•命名
•Hin dⅢ •Haemophilus influenzae d株
•流感嗜血杆菌d株的第三种酶
•属 系 株 序
•
•
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第一个字母取自产生该酶的细菌属名， 用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用 小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 扬州大学《现代分子生物学》5分子
生物学研究方法
•5.1 重组DNA技术发展史
•Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
和鉴定； ▪ 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一
酶切位点，称为多克隆位点； ▪ 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
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•5.1 重组DNA技术发展史
§ 噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12 个核苷酸5′端突出粘性末端
•筛选
•表型筛选
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•酶切电泳鉴定
•菌落原位杂交
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•5.1 重组DNA技术发展史
•5.1.5重组DNA技术的意义
▪ 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 ▪ 重组DNA技术缩短了进化时间 ▪ 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造 ▪ 体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，
•表达载体(expression vector) • 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多 肽链而特意设计的载体称为表达载体。
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•5.1 重组DNA技术发展史
•载体的选择标准
▪ 能自主复制； ▪ 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选
••GCATGC•+••GCTAGC •平端切口
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••GCCTA•+••GATCGC G •粘端切口
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•5.1 重组DNA技术发展史
▪ DNA连接酶: 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片 断连接成一个整体DNA分子。
▪ T4¯DNA连接酶 ▪ EcoR I 连接酶 ▪ T7¯DNA连接酶
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•5.1 重组DNA技术发展史
目的基因的来源
§ 原
•天然DNA
•（染色体DNA、病 毒DNA(噬菌体DNA)、 质粒DNA、线粒体 DNA和叶绿体DNA）
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从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上 各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意 义。
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•5.1 重组DNA技术发展史
•5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶
酶类 限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ
反转录酶
多核苷酸激酶 末端转移酶 DNA外切酶Ⅲ λ噬菌体DNA外切酶 碱性磷酸酯酶
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•5.1 重组DNA技术发展史
•5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基
▪ 1、DNA分子的切割与连接技术
▪ 限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学 家有了进行DNA操作的基本工具。
▪ 2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立
Байду номын сангаас
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•5.2 常见的DNA操作技术
蓝白斑
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•5.2 常见的DNA操作技术
转化率的计算：
§ 转化体总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂 板菌液体积）
§ 插入频率＝白色菌落数/蓝色菌落数+白色菌落数 § 转化频率＝转化体总数/加入质粒DNA的量（计算
使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过 高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。
•菌液：生长对数期 •场强(最大转化效率)：12.5-15kV/cm
• 温度：0-4℃
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•5.2 常见的DNA操作技术
克隆的筛选：
§ 抗生素基因。 § 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、
•即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排 列呈回文对称的序列。
•GGATC C •GCCTAG
•切口 ：平端切口、粘端切口
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•5.1 重组DNA技术发展史
•HindⅡ
•GTCGAC •CAGCTG
•Bam HⅠ
•GGATCC •CCTAGG
•λ噬菌体
▪ 黏粒、YAC、BAC ：高容量载体
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•5.1 重组DNA技术发展史