慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染
一、包装
1.包装细胞
™（P11）; ™ (P16)
2.病毒载体及包装质粒
病毒载体：组构建及中量提取；
包装质粒：商品化产品（™（P12）; ™ (P17)）或中量提取（目前唯一使用来源）；
3.细胞转染
方法一：
™（P12）;
™ (P17)；
方法二：
按照™ & (.15338)进行，简要中文说明如下：
a. 转染前24小时，把4–5 x 106个293T细胞传代至10培养皿中，加入完全培养基至终体积10，培养过夜，转染时，细胞密度为80–90%；
b. 293T细胞转染前2小时换上9新鲜的完全培养基；
c. 用之前充分混匀，在管中加入15的混合物( ：：：的摩
尔比为1：1：1：1)，15的，用定容到500，标记为 1，温和混匀，室温孵育5分钟；
d. 充分混匀，在管中加入45的和455的，标记为 2，
温和混匀；
e. 将 1的溶液加到 2中，温和混匀，室温孵育5分钟；
1 ( )
2 ()
15 ( ：：：1:1:1:1)455 µl
15 µl 45 µl
500µl 500 µl
500 µl
f. 将1 转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100皿中，边加边摇匀。

g. 将细胞放入置于37 ℃、5 2 培养箱中培养，12小时后换
上新鲜的培养基继续培养。

h. 转染后48-72h，收取培养上清，500g离心10或利用0.45 μm 低蛋白吸附滤膜去除细胞碎片和团聚的病毒；
方法三：
C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒（目前唯一使用方法）
4.病毒上清收集
转染后12h, 48h,72h分别收集一次；
二、纯化
方法一：
(i) 病毒上清（接一、包装 4.病毒收集）.
() 51 a 50% 6000 .
() 21.7 a 4 M .
() 23.3 . a 300 . 6000 8.5%
B0.3 M.
(v) 150 250 .
() 4 1C 1.5 h. 20–30 .
() 7,000g 10 4 1C a 10.500 .
() , a .
() 1.2 50 , 7.4, .
.
(x) 20–30 s .
() 100 .
() -80 。

C.
a. 把去除细胞碎片和团聚的病毒上清转移至离心管，按照10的病毒上清加入2.5的506000混合；
b. 加入1.064的4M的混匀；
c. 加入1.142的混匀；
d. 4°C下，孵育1.5h，每20-30颠倒混匀；
e. 4°C下，7000g离心10。

f.小心移除上清，切勿触动白色沉淀，如果白色沉淀出现松动，可以在7000 g下短暂离心；
g. 加入原病毒上清1/200 1/100 体积的重悬沉淀病毒粒子；
h. 立即对浓缩纯化的病毒粒子进行滴度测定，并分装后（50-100管）冻存于-80°C超低温冰箱中；
上述所需试剂配制方法见, 1 （P3）
方法二：
™
三、滴度测定
病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒；
病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒；
四、感染
™（P16）;
™ (P20)；
™（病毒感染增强剂使用说明）；
a. 感染前24小时，把细胞传代至35 平皿中，加入完全培养基至终体积3，培养过夜，感染时，细胞密度为80–90%；
b. 把冻存于-80°C的病毒取出并在室温下冻融；
c. 用新的完全培养基更换培养液，并加入冻融的病毒粒子（为5-10）和（4 μ），培养液终体积为3；
d. 感染8-24h后，用新3-4新完全培养基更换感染培养液；
e. 感染48小时后收取细胞进行检测，感染72小时后收取细胞进行检测；。