细胞工程实验报告专业：生物技术班级：0801 姓名：励丹学号：30804305一、实验目的1、了解动物细胞培养的相关实验器材以及实验前器材的清洗与消毒、无菌室灭菌与消毒等基本方法，以建立起无菌操作的概念。

2、了解和掌握动物细胞原代培养的基本方法，熟悉组织块法和消化法培养的基本操作过程。

初步掌握无菌操作技术。

3、学习与了解细胞超低温冻存于复苏的基本原理，初步掌握培养细胞常规超低温冻存于复苏以及玻璃化超低温冻存于复苏的方法。

4、掌握ELISA测定抗体效价的方法，细胞的超低温冻存和复苏，及MTT法测定细胞活性的方法。

5、学习和掌握制备饲养层细胞的方法，为杂交瘤细胞的制备做准备。

6、学习从脾脏组织制备免疫细胞的方法，从免疫脾脏中制备免疫细胞悬液，用于杂交瘤细胞的融合。

7、学习和掌握动物细胞融合的基本方法，通过免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，并进行选择。

8、学会细胞形态的观察和分析，细胞技术等细胞培养中常见的问题。

二、实验原理1、原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后直到第一次传代为止。

原代培养首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织或器官，切成一定大小的组织块，直接或经消化分散成单个游离的细胞，在人工培养条件下，使其不断地生长、繁殖。

2、细胞活性测定——MTT法MTT法是利用细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶四氮唑蓝还原成难溶的蓝紫色结晶——甲瓒，经二甲基亚砜（DMSO）溶解后，在490nm处测吸收值，其吸收值可间接反映细胞的活性状态及活细胞数量。

3、培养细胞的超低温冻存于复苏为了保持细胞株（系）遗传的稳定性以及非连续使用细胞的长期保存，建立了细胞超低温冻存于复苏技术。

目前细胞超低温冻存技术主要有两种方法，即常规超低温冻存和玻璃化超低温冻存。

活细胞在超低温下克服了分子间的热运动，因而可长期保存而不影响活力。

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。

如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。

在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。

贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

4、饲养层细胞的制备在体外培养细胞实验中，对于难养的细胞或者数量较少的细胞，常常需要预先在培养瓶或培养板底部加入一些活的原代细胞或者静息的肿瘤细胞以辅助目的细胞的生长，这就是饲养层细胞。

它可能在饲养细胞的生长过程中会释放一些细胞生长刺激因子或提供细胞接触的信号。

5、免疫脾细胞的制备小鼠经抗原多次免疫后，可从脾脏组织细胞分裂和分化出较多能分泌相应抗体的B淋巴细胞，脾脏内细胞连接不紧密可通过机械分离和过滤网筛选，将这些细胞制备成游离的单个细胞悬液。

6、杂交瘤细胞的制备（细胞融合）通过对免疫动物B细胞和某一个永久细胞系进行融合，杂交后代称之为杂交瘤。

杂交瘤细胞可以将分泌特异性抗体B细胞的遗传特性和骨髓瘤细胞系体外增殖的遗传特性合二为一。

一种淋巴细胞克隆只产生一种特异性抗体；细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持亲代双方的特性；杂交瘤细胞的筛选，体外培养大量增殖，获得所需抗体。

7、ELISA检测使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。

由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

三、实验内容1、动物细胞培养技术2、杂交瘤技术与单克隆抗体制备3、细胞工程相关技术1）动物细胞培养实验器材的准备无菌室：首次启用的无菌室一般可采用福尔马林熏蒸（5～6m2无菌室用KMnO4 50g，倒入100ml甲醛（用搪瓷盘），冒浓烟，24hr，氨水中和至无甲醛味），经常使用的无菌室在每次实验前必须开启紫外灯照射0.5至l小时，然后避光0.5至l小时后方可进入操作。

培养器材的消毒：干热灭菌法：玻璃器皿、金属器具等的消毒方法，140～150℃，2～3小时；湿热灭菌法：橡胶制品、无菌衣、帽和口罩以及除菌过滤器的清毒，高压蒸汽灭菌15磅20—30分钟；紫外线照射灭菌：多孔培养板的灭菌－30分钟。

抽滤除菌：培养基等（培养基通过0.22过滤装置－除菌）2）杂交瘤技术与单克隆抗体制备1、小鼠的免疫方法：脾脏直接注射：一般免疫后3～4天即可制备抗体。

其它途径注射：一般采用间隔免疫的方法，分3次，间隔2～3周进行免疫。

步骤：取绵羊静脉血0.2mL（加肝素或枸橼酸钠抗凝）用0.9％NaCl或PBS 1000~ 1500rpm离心5分钟涤洗3次，收集血细胞。

血球计数板计数，用0.9％NaCl或PBS调整细胞浓度至4×107个/ml（10个/小格）。

向小鼠腹腔注射血细胞悬液0.5ml 。

每隔15天重复注射作加强免疫，共重复2次，第2次加强免疫后10天，检测血清效价，若血清效价低则要继续免疫。

小鼠处死前2～3天加强免疫1次，以活化B淋巴细胞。

注：细胞计数：一个大方格被分成16个中方格。

每一个大方格边长为1mm，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。

一个大方格被分成16个中方格。

每一个大方格边长为1mm，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。

细胞浓度（个/ml）=细胞数/体积即：细胞浓度（个/ml）= 一个大格的细胞数×104。

打入的免疫红细胞数要在一定范围内，细胞数量太多会免疫耐受；太少得到的免疫细胞数少。

2、小鼠血清的制备取五只没有免疫过的小鼠---每只小鼠眼球取血0.5mL以上于1mLEP管中----小鼠短颈处死后，放于装有75%酒精的烧杯中消毒灭菌，带入无菌室备用——取出血清放于37℃水浴保温30min——2000转离心10min——取上清于干净的离心管中，作为ELISA的阴性对照取五只免疫过的小鼠——同上操作——取血清作为ELISA的阳性对照3、单克隆抗体的制备流程4、骨髓瘤细胞的培养1、选择生长旺盛，形态良好的细胞2、将上清倒入离心管内，剩余贴壁的细胞用0.02％EDTA消化液消化细胞5分钟后倒入同一离心管，1000～1500rpm离心5分钟，收集细胞。

3、加6mL含10％小牛血清的DMEM培养液悬浮细胞，分装于两个细胞培养瓶，5％CO2培养箱37℃培养。

5、饲养层细胞的制备1、每组1只小鼠，断颈处死后浸泡在75％乙醇消毒5分钟。

2、在无菌室内小心剪开小鼠腹部皮肤，暴露腹腔，用注射器腹腔注射3～4ml 1640培养液，按摩片刻。

3、左手用镊子夹起腹腔肌肉，右手用剪刀剪开一个小口，小心用吸管吸出腹腔液体于离心管。

4、低速离心洗涤细胞一次后，用12~15ml 1640培养液悬浮细胞（5×104），取100~200l滴96孔板（一般用吸管滴2~3滴）。

5、免疫脾细胞的制备1.将免疫过并取完血清后的浸泡在75％乙醇中的小鼠带入无菌室。

2.小心剪开腹腔，取出脾脏。

3.用一次性注射器将脾脏刺几个洞，再吸3～4mLPBS液吹打脾脏。

4.收集吹打的细胞悬液，经低速离心洗涤后将细胞悬浮在培养液。

6、杂交瘤细胞的制备（细胞融合）1.将骨髓瘤细胞(2×107）与脾细胞按1:10的比例混合，低速离心后弃上清，用手指弹匀细胞。

2.将1mL50％的PEG在1分钟内缓缓加到混合的细胞内，注意边滴加PEG边摇动离心管。

3.PEG作用1分钟后，迅速滴加培养液终止PEG作用，低速离心洗涤细胞。

4.用10mLDEME培养液悬浮融合细胞，按每孔3滴的量滴加到含滋养层的96孔板内，置37℃5％CO2培养箱中培养。

（注：因为实验时间有限，我们只是操练单克隆抗体的制备方法和过程，并没有制备到单克隆抗体，但是单克隆抗体的制备过程和操作注意事项已经基本了解。

）3）原代细胞的培养组织块法培养小鼠肝脏组织:1.取出肝脏，经PBS漂洗三次后，放在表面皿中。

2.在表面皿中，用滴管加入少量PBS（RPMI1640含20％小牛血清，0.2%白蛋白，10ug/ml胰岛素，100U青霉素和链霉素）用锋利的剪刀将组织块剪成约1mm3的小块。

3.用弯头镊子将组织小块移入细胞瓶中，把它们排列成行，每块组织相距约0.5cm，每瓶细胞贴20～30小块，随即翻转细胞瓶，使贴组织块的一面朝上，然后加培养液3ml。

4．将细胞瓶置于37℃，5％CO2培养箱中静置2~4小时，然后将瓶轻轻翻转，使组织块浸入培养液中，继续静止培养。

5．72小时后在显微镜下检查，若见细胞自组织边缘长出，则继续培养3-5日，再换部分或全部培养液，待多数组织块的生长晕相接时，可进行传代培养。

肝细胞培养的实验结果：若培养液显为淡黄且清澈，一般显示细胞生长良好。

培养3～5日，在相差显微镜下观察，若见细胞自组织边缘长出，更换部分或全部培养液，待多数组织块的生长晕相接，小心挑掉组织块，继续培养3～4天。

7天左右后，生长晕扩大到直径为15mm左右小鼠肝脏细胞原代培养的生长晕是多角形上皮样细胞与梭形细胞混合的细胞群体。

24～48小时后若培养液变成黄色且混浊，表示已被污染；若培养液变成紫色，一般细胞生长不好，则培养液pH过高；消化法培养小鼠肾细胞:1、将消毒过的小鼠，剖腹取出肾脏于放有ＰＢＳ的培养皿中洗涤。

2、尽量剪碎肾脏。

3、用ＰＢＳ洗涤２～３次。

4、加入５mL胰酶，37℃（30min）。

5、过筛，１０００转离心１０min，用PBS洗涤2~3次。

6、加培养液，计数至3~5×105/Ml.(1.5个每中格)。

7、细胞悬液装瓶3mL 放于CO2培养箱培养。

4）抗体IgG ELISA检测1.取0.2ml绵羊红细胞，加6ml PBS 1000rpm离心10min洗涤，重复一次。

2.取下层红细胞，加1.2ml磷酸盐缓冲液（Na2HPO45mmol/L, NaH2PO45mmol/L pH7.6）（低渗）混匀后，常温处理20~25min，4℃12000~13000 rpm离心15min，去上清，重复一次。

3.取乳白色沉淀（血影）用包被液稀释至后，按50g（老师制备）加入96孔酶标板内，放于湿盒4℃冰箱过夜，备用。

4.吸去孔中的抗原液（自制吸头，这样冲击力会小，不会使包被的抗原脱落），用洗涤液洗涤3次（将洗涤液沿孔壁注入200L/孔，放置3分钟，甩去洗涤液，重新注入），加封闭液（含1％牛血清白蛋白的洗涤液）200L/孔，封闭30min。