5. 信息量较少
有/ 无信息，以及ELISA 的亲和力信息
Biacore基本原理
BIACORE = Bio-molecule Interaction Analysis Core-technology
1）基于表面等离子共振技术（SPR）；
2）无需对研究对象进行标记； 3）全程实时监测分子相互作用；
4）不受样品颜色和浊度的影响；
常用的分子互作技术
对于涉及蛋白质相互作用的研究
1. 酵母双杂交 2. 酶联免疫吸附分析（ELISA ） 3. 荧光共振能量转移（FRET ） 4. 免疫共沉淀（Co-IP ）
5. 免疫印记（Western, Far-Western）
6. 质谱技术（Mass Spectrometry ）
对于涉及核酸相互作用的研究
国内研究成果：为什么禽流感可以感染人类？
基于Biacore 3000数据揭示H5N1禽流感跨物种传播机制
病毒对受体的结合能力
禽源受体
人源受体
新药发现:
利用Biacore进行基于药靶结合的药 物分子筛选与设计 (化药、抗体、重组蛋白、疫苗开发)
Acknowledgements to Avidex LTD
通过相互作用的强弱的变化。举例：磷
酸化修饰。 • 错误/失调的生物分子互作导致人体、动
植物、微生物各种病理现象的发生（例
如突变、甲基化）
常见的分子相互作用例子
• 药物小分子与细胞表面受体的相互作用；
•
• • • • • •
转录因子对核酸关键序列（如启动子、增强子等）的调节；
蛋白磷酸化/去磷酸化后的功能变化。 低分子量的“第二信使” 与生物大分子之间的相互作用； 蛋白质复合体多个亚基之间的组装与调节； 免疫反应中T cell与病原体表面抗原之间的识别； 酶分子与其激活剂或者抑制剂之间的相互作用； 生物分子在质膜与核膜之间的转位及调节；
100
p6 protein
1
52
33 27 13
Percent Bound
80
60
40
所有曲线和野生型类似
KDs = 15 - 27 mM
20
0 1.E-09
1.E-08
1.E-07
1.E-06
1.E-05
1.E-04
1.E-03
1.E-02
[Tsg101] (M)
120 通过突变寻找 p6上结合位点的确切位置 100
100
● KD = 25 mM
0
00
-9.042223 -100
0
15 30 Time (s)
45
1 .000E-07 10-7
1 .000E-06 10-6
1 .000E-05 10-5
1 .000E-04 10-4
1 .000E-03 10-3
[Tsg101] (M)
-200
对120 p6进行剪切，确认结合位点
Slowest off-rate C2 C3 A
Cell Assay C2 C3
2nd 3rd
A
C1 B4
4th
5th
(Data from Kalobios Pharmaceuticals)
C1
B4
C2
A
C1
B4
• Biacore获得的动力学结果与细胞实验数据高度一致
– 解离数率(kd) : 其预测结果与细胞实验排序一致 – 结合速率(ka) : 与细胞实验数据不关联
1. EMSA 2. ChIP （染色体免疫沉淀法，Co-IP 的类似技术）
目前分子互作技术的特征
1. 终点技术（End-point Tech）
酵母双杂，ELISA ，Co-IP，ChIP ，Western，MassSpec.
2. 需要标记（Require Labeling ）
酵母双杂，ELISA ，FRET
Detergent-solubilized GPCRs
Ab captured on sensor surface
Biacore技术应用领域
• 新药发现 • 抗体药物开发 • 疫苗开发 • 免疫学 • 肿瘤研究 • 神经疾病 • 传染疾病 • 功能蛋白质组学 • 细胞信号传导 • 蛋白质构效关系 • ……
• 从与CD80的亲和力上看，E系列并不比A-D系列更具优势。 -基于亲和力Avidex 将放弃E系列化合物 • 但动力学数据显示E系列具有更低的解离速率 -从药代PD角度：具有更低的解离速率的化合物更具潜力 -对E系列进一步结构优化可以集中在提高结合速率 on-rate • E系列化合物由于其特别的动力学特征而被保留于进一步开发。
1 mM
0 mM KD = 10 nM kon = 103 (M-1S-1) koff = 10-5 (S-1) KD = 100 pM kon = 107 (M-1S-1) koff = 10-3 (S-1)
87 % occupied
= 19 minutes = 2 hours = 19 hours = 8 days
5）样品用量微少
Biacore基于广泛认可的SPR技术 （表面等离子共振技术）
表面等离子共振原理 (SPR)
Biacore提供实时、非标记的分子结合信息
选择性
药-靶特异性结合？ 启动子的识别序列？
结合信号
活性浓度
混合物中目标成分浓度? 发现已知分子的结合伴侣
时间
亲和力
动力学
热动力学 生理温度下(37℃)结合性能
Courtesy of KaloBios Pharmaceuticals Inc.
动力学数据筛选CD80抑制剂先导化合物中的重 要作用
• Avidex Ltd 治疗类风湿性关节炎药物开发项目 • T细胞激活过程中CD80/CD28 信号传递的抑制剂 (靶分子 = CD80) -按照结构特点将259个先导化合物分为 A-E 共5个系列 -利用Biacore对259 个化合物分子进行动力学分析与筛选 • 所有化合物的动力学数据都标记在on/off 图上 -全面掌握每个系列化合物的整体动力学特征 -能够发现一些特殊的化合物
Data courtesy of Avidex Ltd
基于动力学特征对化合物进行有效筛选
亲和力提高 结合速率 解离速率
• 从A到D系列亲和力不断提高
• 动力学数据显示: 尽管E系列的亲和力中 等强度，但其解离速率非常慢。
Data courtesy of Avidex Ltd
动力学数据挽救了更具潜力的化合物
• 生产批次结合活性放行
28
从开发到质控， Biacore贯穿药物开发的每一步
SPR-HPLC联用进行药物活性成分的鉴定
独特的配体垂钓及回收功能 (SPR-MS & SPR-HPLC）
MALDI-TOF-TOF鉴定
回收 点靶 样品回收 点靶及在位酶解 LC-MS/MS模式 垂钓 回收
药物活性成分的筛选-AFTIR (利用SPR-HPLC方法）
解离速率(off-rate)决定药物的在靶滞留时间
Both drugs with identical and rapid clearance (short plasma t½ )
Concentration 100 % occupied 92 % occupied koff (s-1) 10-3 10-4 10-5 10-6 Residence time - t½
Percent Bound
80
T8A A9G P7L P10A P10L
60
40
必需的 PTAP序列
20
0 1.E-09
1.E-08
1.E-07
1.E-06
1.E-05
1.E-04
1.E-03
1.E-02
[Tsg101] (M)
p6/Tsg101片段的结合位点
Affinity of Tsg101 Mutatants
D. Myskza, W. Sundquist et al.,Univ. of Utah and Myriad Genetics
分析p6/Tsg101的相互作用
uninduced induced
Tsg101
HIV-1 p6
GST-HIV p6
GST
anti-GST mAb
Anti-GST surface purifies and orients the GST-p6 fusion protein
结合强度？结构-功能关系？药-靶结合时间？
Biacore可研究的生物分子范围
• 蛋白质、抗体 • DNA/RNA • 脂类 / 生物膜/膜蛋白 • 多糖/糖蛋白 • 多肽 • 小分子、激素 • 药物化合物、片段化合物 • 全细胞/病毒/微生物
CD4/gp120 natural chemokine LMW compound mAb
0 % occupied
1 2 Time (h)
结合动力学数据是药物开发中重要的药物理化信息之一
解离速率决定药物的实际疗效 (potency)
B4 C1 A C3 C2 Rank 1st
increasing potency of Fabs
Highest affinity C2/C3 A
Fastest on-rate C1 B4 C3
Biacore应用实例1 HIV萌芽机制研究
matrix capsid
nuclear capsid
p6
缺失p6 使HIV 被细胞膜内吞
HIV-1 Gag
• HIV 蛋白 p6 对于病毒颗粒在细胞 中的萌芽是必须的
• 曾有报道人的Tsg101和液泡蛋白分 选有关
• 研究p6蛋白与Tsg101是否存在相互 作用？