o AOX1基因与AOX2基因序列相似，有92%的同源性， 其编码蛋白有97%的同源性，但AOX1基因的编码产 物在氧化过程起主要作用. o 甲醇能诱导AOX的合成，而甘油和葡萄糖则抑制AOX 的产生。 o 当细胞以葡萄糖、甘油、乙醇为碳源生长时不能检 测到AOX1的活性，而在甲醇培养的细胞中，该酶可 大量产生。 o 表达载体大多是利用AOX1启动子的强诱导性使它下 游的外源基因易于调控，并具有很高的表达量。
1．酿酒酵母自身的改造
⑴ 将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母，水解多糖
⑵ 将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母,水解 麦汁中蛋白 ⑶ 将β-葡聚糖酶基因导入酵母， 水解β-葡聚 糖 ⑷ 将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒 酵母体内表达，促进SO2产生 ⑸ 将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵 母
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15.1.1 酵母基因工程的优点
① 是真核生物，大多具有较高的安全性； ② 繁殖速度快，能大规模生产，具有降低基因工 程产品成作技术与真 核生物中复杂的转译后修饰能力相结合，能方 便地用于外源基因的操作； ④ 采用高表达启动子，可高效表达目的基因，而 且可诱导调控； ⑤ 提供了翻译后加工和分泌的环境，使得产物与 天然蛋白一样或类似；
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② 整合型载体
o 整合在酵母细胞染色体基因组DNA上，稳定性高, 但拷贝数量低。 o 不含酵母的复制起始区，而是含与受体菌株基 因组有某种程度同源性的一段DNA序列，能有效 介导载体与宿主染色体之间发生同源重组，使 载体整合到宿主染色体上并随同酵母染色体一 起复制。
外源基因整合靶位点—酵母rDNA单元 o 酵母rDNA单元大小为9.1kb，每个单元包含 有35S rRNA前体和5S rRNA基因，这两个转 录单元之间有非翻译区（NTS），在非翻译 区含有DNA复制原点，如图15-1所示。 o 在rDNA单元中有两个HOT区（激活rDNA间的 重组）和一个TOP区（抑制rDNA间的重组）。 o 如果所取rDNA片段只有HOT区，就容易发生 重组，整合拷贝就容易丢失。 o 如果所取的rDNA片段既有HOT区，又有TOP 区，或者两者都不存在，整合拷贝间就不 容易重组，整合拷贝就很稳定。
1．酿酒酵母表达系统
o 酿酒酵母很早就被应用于食品和饮料工业， 是发酵工业中的主要生产菌株，是人们最先 建立的酵母表达系统。 o 已发展和建立的酿酒酵母表达载体:附加型 和整合型。
⑴ 附加型表达载体
o 多为大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达质粒 o 酵母部分：酵母菌的2μm质粒的复制区 o 选择元件：营养缺陷型相关的基因如LEU2、HIS4 和URA3基因。 o 表达盒式结构： 启动子：乙醇脱氢酶启动子PADH1、半乳糖诱导 型启动子PGAL； 分泌信号：酿酒酵母自身α-交配因子的分泌信 号； 终止子：CYC1基因的转录终止子。
② 选择标记 o 常用HIS4，以及ARG4、TRP1或URA3作选择标记 的载体。 o 巴斯德毕赤酵母不能利用蔗糖，所以可用来源 于酿酒酵母的蔗糖酶基因SUC2作为选择标记。 o 抗性选择标记有抗生素G418抗性基因和Zeocin 抗性基因（一种强诱变剂）。
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leu-作为酵母载体的选择标记基因
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酵母表达载体主要元件 ①启动子 o 最常用的启动子是基因AOX1的启动子，在它控制 下的外源基因在甲醇诱导时能得到高效表达。 o PGAP（三磷酸甘油醛脱氢酶启动子）：在毕赤酵 母中克隆到的一个组成型启动子，在它控制下的 β-LacZ 基因表达率比甲醇诱导下的以PAOX1启动 的产量更高。 o PGAP不需要甲醇诱导，发酵工艺更为简单，又因 其产量很高，所以成为代替PAOX1的最具潜力的启 动子。
2．宿主
作为酵母表达系统的宿主应具备以下条件： 安全无毒，不致病 遗传背景清楚，容易进行遗传操作 构建的载体DNA容易进入，转化频率较高 发酵周期短，培养条件简单，容易进行高密度 发酵 ⑸ 蛋白质分泌能力良好 ⑹ 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功 能 o ⑴ ⑵ ⑶ ⑷
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3．酵母的DNA转化
15.1.3 发展趋势
1．解决酵母基因工程中还存在的缺陷 2．在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的 发展方向 3．利用酵母基因工程筛选更多的新药 4．改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本 5．酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注
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15.2 酵母表达系统
15.2.1 酵母表达载体
典型的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭 质粒。 o 原核部分：大肠杆菌中ori和抗生素抗性序列。 o 酵母部分：维持复制的元件，如附加型的2μm质 粒复制起点序列，或染色体的自主复制序列 （auto-replication sequence, ARS），或整合 型载体的整合介导区；酵母转化子的筛选组分以 及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。 o 分泌型表达载体还要带有信号肽序列
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甲醇酵母表达系统优点：
① 启动子强,且受甲醇严格诱导，因此可用于调控
② ③ ④ ⑤
外源蛋白的表达。 作为真核表达系统，能对重组蛋白进行翻译后必 要的剪接、折叠和修饰，糖基化也更接近高等真 核生物。 操作简单易行，但外源蛋白的表达量却比酿酒酵 母增加了10-100倍。 重组菌的遗传性质稳定，表达量和分泌效率高， 适于大规模发酵。 高密度培养干细胞量可达100g/L以上。
第15章
酵母基因工程
o 酵母基因工程的发展 o 酵母表达系统 o 酿酒基因工程的应用
15.1 酵母基因工程的发展
o 酵母菌是一类群体庞大的单细胞真核微生物， 种类繁多，至少包括80个属，600多种，10 000 多菌株。 o 酵母菌有完整的亚细胞结构和严谨的基因表达 调控机制，它既能通过有丝分裂进行无性繁 殖，也可通过减数分裂实现有性繁殖。
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2．酵母表达异源蛋白
⑴ 表达水平 o 酵母的高效表达:通过开发高效的启动子提高 和控制外源基因的转录水平；提高表达载体在 细胞中的稳定性；通过多次同源重组以及介导 的整合两种方式提高表达基因在细胞中的拷贝 数。 ⑵ 表达质量 o 提高酵母的遗传稳定性。 o 根据表达蛋白的不同，选用不同的酵母宿主。
⑥ 酵母菌可将表达的外源蛋白与末端前导肽融合，指 导新生肽分泌，同时在分泌过程中可对表达的蛋白 进行糖基化修饰； ⑦ 不会形成不溶性的包涵体，易于分离提纯； ⑧ 移去起始甲硫氨酸，避免了在作为药物使用中引起 免疫反应的问题； ⑨ 酵母菌（主要是酿酒酵母）已完成全基因组测序， 它具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对 表达产物的加工修饰及分泌能力； ⑩ 酵母可进行蛋白的N-乙酰化、C-甲基化，对定向到 膜的胞内表达蛋白具有重要作用。
（2）载体的复制形式
① 附加型载体 o 在酵母宿主中的拷贝数量大，但在传代过程中 易丢失，影响重组菌的稳定性和表达量。 o 两类： （1）利用酿酒酵母2μm质粒的DNA复制有关的 元件所构建，这类载体转化效率很高，每 μgDNA可得103-104个转化子； （2）利用酵母基因组DNA的自主复制序列，能 在酵母染色体外自主复制。
⑴ 原生质体法 转化效率不稳定，转化时间长、成本 较高。 ⑵ 离子溶液法 将酵母细胞用各种离子（如Cs＋、Li＋） 溶液进行处理，然后进行DNA转化，能明显增加外源 DNA的吸入。优点是操作简便、易掌握。 ⑶ PEG1000法 通过PEG处理酵母细胞获得类感受态再 转化。 ⑷ 电穿孔法和粒子轰击法（particle bombardment或 biolistics） 优点是转化效率最高，常用于一些新 的酵母宿主细胞的DNA转化。缺点是需要特殊的设备、 成本较高，所以不是常规的转化方法。
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15.1.2 发展现状
o 在酵母基因工程中发展和应用较多的酵母: 酿酒酵母 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 烷烃利用型降脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica） 粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） o 应用:改造酵母本身用以提高发酵性能和表达异源 蛋白两方面。
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图15-3 酿酒酵母rDNA介导的整合型分泌表达载体
启动子类型 诱导型 o PGAL在半乳糖存在的条件下表达水平提高1 000 倍，诱导表达GAL1、GAL7及GAL10基因产物占细 胞总蛋白的0.5%-1.5%，是常用的启动子。 组成型 o 用Kex2酶切去由重组蛋白与酵母α-交配因子的 前导序列融合的部分。 提高拷贝数： ① 用酵母转座子以产生多个插入拷贝； ② 通过rDNA介导的重组插入到核糖体DNA簇中在 宿主染色体上以约150个串联重复序列存在。
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图15-2 酿酒酵母附加型表达载体
图15-2：酿酒酵母利用2μm质粒复制区的自主复制型表达载体 （1）pYES2：不带信号肽序列可在胞内或胞外表达 （2）pHBM363：带有信号肽的分泌表达载体
⑵ 整合型表达载体
o 没有在酵母中复制的质粒复制区，利用同源片 段将载体整合到染色体上。 o 与附加型载体一样，该类载体也有用于酵母转 化的选择元件和原核生物部分的复制起始序列 以及某种抗性基因。
4．酵母分泌外源蛋白的糖基化
o 不同酵母细胞对分泌蛋白的糖基化方式和程度 不同，加到分泌蛋白上的碳水化合物的长度和 结构是由酵母本身决定的。 o 酿酒酵母分泌的糖蛋白大多数是过度糖基化 （＞40个甘露糖残基） o 巴斯德毕赤酵母分泌的糖蛋白的寡糖链8-14个 甘露糖
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15.2.2 常用酵母表达系统
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NTS1 RFB 5S
NTS2 ARS 18S 35S 5.8S
25S
图15-1 酵母rDNA单元结构示意图
ARS: an autonomous replicating sequence RFB: a replication fork barrier NTS: non-transcribed regions