第七章 酵母菌的基因工程
Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells
一. 酵母克隆载体
① 能在E.coli中克隆和扩增。 Ori ②有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 ③ 有酵母的选择标记 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;
如pYF92:
pBR322 2m 酵母his 3+
2m质粒： 酿酒酵母的内源质粒，长度是2m 。含有自主 复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维 持稳定）。
特点：
①很高的转化活性（103-105转化子/微克 DNA）. ②拷贝数多（25-100分子/细胞）。 ③比YRp稳定。
YEp24
亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱 氢酶
• 该酶是把丙酮酸转化成亮氨酸的代谢酶之 一．只要使用亮氨酸lue2突变的营养缺陷型 酵母作受体，载体上带有亮氨酸lue2基因就 能在不含亮氨酸的培养基上实现转化克隆 的筛选（书１７０页图）．
四. 酵母表达系统的特点
（1）优点 ①对其遗传学和生理学的研究比较深入。 ②小量培养和大规模反应器中都能生长。 ③已经分离出很强的启动子。 ④有翻译后的加工。 ⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。 ⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。
④不稳定，容易丢失。
（3）着丝粒质粒(YCp) 在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒 区。 YRp质粒 酵母着丝粒 特点： ①行为像染色体，能稳定遗传。 ②单拷贝存在。
③不易从细胞中提取。
（4）附加体型载体(YEp) 由大肠杆菌质粒、2m质粒及酵母染色体 DNA选择标记构成。 大肠杆菌质粒 2m质粒 酵母选择标记
诊断试剂
人类治疗用蛋白药物 上皮生长因子 胰岛素 类胰岛素生长因子 血小板源生长因子 胰岛素前体 成纤维细胞生长因子 集落刺激因子 1抗胰蛋白酶 凝母中表达 嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特点 • 在大型发酵反应器中容易生长； • 以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。 • 有甲醇时，表达的乙醇氧化酶高达胞内总 蛋白的40%！
二. 酵母转化和表达的一般过程
Leu- 酵母 酶去壁 原生质体
CaCl2、 感受态 PEG
提取 大肠杆菌 酵母载体
插入外源基因 转化
Leu营养 转化子克隆生长 缺陷型 整合到染色体上， 或独立在酵母细胞内 培养基 筛选 外源基因产物 鉴定克隆 发酵表达 分离、纯化
三.用于转化子筛选的标记
• 大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结 构基因作为选择标记，如lue2，trp1， his3和 ura3 。使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标 记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变 或多点突变），利用遗传互补进行转化体选择的。 • 组氨酸his3—咪唑磷酸甘油脱氢酶; • 亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱氢酶; • 赖氨酸lys2—β-氨基已二酸还原酶; • 色氨酸trp1—N-邻氨基苯甲酸异构酶; • 尿嘧啶ura3—乳清苷-5`-磷酸脱羧酶;
④ 有合适的克隆位点。
（1）整合型载体(YIp) 由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断（选 择标记）构成。
如 PYeleu10: ColE1 酵母Leu 2+
特点： ①转化率低（1-10转化子/微克DNA）。 ②不能在酵母细胞中自主复制 载体上只有细菌的复制区，没有 酵母的自主复制区。 ③整合到酵母的染色体上 可与受体细胞的染色体DNA同源重组， 随染色体一起复制。 ④不能从酵母细胞中提取载体。
（2）复制型载体(YRp) 由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断(选择标记 和酵母DNA自主复制顺序ARS）构成。
大肠杆菌质粒 酵母ARS 酵母选择标记
ARS
ARS（automously replicating sequence）:
250bp
保守区
ATTTTATATTTA T G T
特点： ①转化率高（102-103转化子/微克DNA) 。 ②可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。 ③穿梭载体（shuttle vector） 既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母 细胞中自主复制。
表达载体构建（整合型）：
HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作为疫苗。 Aox1：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。 His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。 3’-aox1：整合到特定染色体的位点序列。
诱导物：甲醇。
产量：9×106剂疫苗/240L发酵罐。
整 合 到 染 色 体 中
（2）缺点 ①表达量普遍低。 ②常常发生质粒丢失。 ③重组蛋白常常超糖基化 每个N-寡糖链上含有100多个甘露糖，
正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-13个甘露糖。
④分泌困难。 分泌型蛋白有时会留在壁膜间隙，
五. 在啤酒酵母中表达的重组蛋白
种类 疫苗 名称 乙肝病毒表面抗原 疟原虫环子孢子蛋白 HIV-1外壳蛋白 丙肝病毒蛋白 HIV-1抗原