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提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
突变类型 生物效应 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 作用位点 钙离子依赖型的ATP酶 转录后加工 转录水平
ssc1 ssc2 rgr1
ose1
ssc11 rho-
提高重组蛋白表达
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL10 Promoter
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7
GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
3）pho4TS-PHO5启动子
低温诱导、磷酸盐抑制 A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录
以酵母标记基因（his3)的5’端和3’ 端作同源序列
3 用于酵母转化子筛选的标记基因
营养缺陷型的互补基因
显性基因
营养缺陷型的互补基因
宿主细胞：为氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变子
主要有：LEU-、TRP-、HIS-、URA载体：携带相应的合成基因 如：leu1/leu2、trp1、his3/his4 、ura3 选择压力：不完全培养基 如：YNB、无机盐培养基
组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活
性与药代稳定性均有影响。
*糖链组成
O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸
基团
4、酿酒酵母表达系统的缺陷
1）表达水平普遍不高
A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp）
B、所采用的强启动子调控不严谨
C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵 2）分泌表达产物过糖基化
缺陷是非致死性的
Ubc4 - ubc5 双突变型：
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
2、酵母载体系统
野生型质粒：2m质粒（酿酒酵母）
人工构建质粒: 5种
酵母附加型质粒（YEp）
酵母复制型质粒（YRp）
酵母着丝粒质粒（YCp)
酵母人工染色体（YAC） 酵母整合型质粒（YIp）
酿酒酵母中的2μ环状质粒
酵母菌表达系统的选择
巴斯德毕赤酵母表达系统
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生 长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长 迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯 德毕赤酵母表达系统的三大优势。 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因 的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种 具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。
YRp质粒
*复制子：染色体来源的ARS
*拷贝数50-100
*不稳定 培养几代后，质粒的丢失率高达 50%-70%，主要是由于分配不均 匀所致。 ARS: auto replication sequence
YCp质粒
*在YRp中引入CEN
CEN：着丝粒序列，来源于3号
染色体，有丝分裂稳定，低拷贝数
毕赤酵母：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
汉逊酵母：多型汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
其它酵母：已有60多种酵母菌建立了转化系统
乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis)
非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
UBI 4缺陷型：
在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 正常生长。
UBA 1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变是致死性的，但其等位基因
酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母表达系统
酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油 醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢 酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得
有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能
2、TATA盒：富含AT；
3、UAS：上游激活序列;
5、DAS：下游激活序列
酿酒酵母表达系统常用启动子
1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：
甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH
磷酸甘油激酶基因PKG
乙醇脱氢酶基因ADH
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL80
GAL4
4 酵母菌转化方法
原生质体转化法
碱金属离子介导转化法
电激转化法
酵母菌原生质体转化法 细胞：去壁的原生质体
原理：以PEG等渗缓冲液稳定原生质体，以Ca2+诱导细胞
摄取外源DNA。
特点：30%以上为多质粒共转化 转化效率：可达原生质体总数的1-2%，但操作周期长，而 且转化效率受到原生质再生率的严重制约。
二、酵母转化系统
酵母宿主系统 酵母载体系统
酵母系统标记基因 酵母转化方法
外源DNA在酵母宿主中的命运
1、酵母宿主系统
用作模式真核生物的酵母宿主菌 用作外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
用作模式真核生物的酵母宿主菌
野生型，双链、环状、6kb 拷贝数达50至100个
IRs 反向重复序列，600 bp，重组
RAF REP1 FLP
IR
A ori IR 同源重组
REP2
FLP 编码产物驱动IRs的同源重组
REP 编码产物控制质粒的稳定性 STB REP的结合位点
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及 克鲁维酵母属中的pKD1等均与2μ质 粒类似。
三 酵母表达系统
酿酒酵母表达系统 甲醇酵母表达系统 其它酵母表达系统
（一） 酿酒酵母表达系统
酿酒酵母系统启动子 酿酒酵母分泌系统 酿酒酵母糖基化系统 酿酒酵母表达系统存在的问题
1、酿酒酵母启动子
起始 位点 DAS 编码序列
UAS
URS
TATA
mRNA 40-120bp 20-40bp 100-1400bp 1、转录起始位点； 4、URS：上游阻遏序列
STB
B
人工构建酵母质粒的共同特点
含有大肠杆菌质粒的复制元点，以便克隆操作 含有一定数量供克隆操作的单一酶切位点 含有在酵母和大肠杆菌中进行选择的双标记 除YIp型质粒外均为穿梭载体
YEp质粒
*复制子：2m质粒来源的ori
*拷贝数50-100
*不稳定 培养几代后，质粒的丢失率高 达50%-70%，主要是由于分配 不均匀所致。
酿酒酵母（Saccharomyces cereviasiae）：
*无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真核生物 *繁殖方式与原核类似，易于操作
*基因表达调控机理与高等真核类似
用作外源基因表达的酵母宿主菌
酿酒酵母： 最成熟的真核细胞表达系统，表达水平低，产物过度糖基化
甲醇酵母：可以利用甲醇作唯一碳源，表达水平高，产物糖基化更合理
特点：转化率高（105 / mg DNA）、操作简便、适用范围广
5 外源DNA在酵母宿主细胞中的命运
单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍 含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制 不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体 外源DNA常通过同源或非同源方式与染色体DNA重组 线性化DNA更易于同源重组
*复制子：染色体来源的ARS *拷贝数：1-5
YAC质粒
*在YCp中引入TEL
TEL：端粒，染色体末端序列，
利于线性DNA末端稳定
稳定性：随着插入杆菌的复制子
*引入酵母基因组的同源序列
*载体以同源或非同源重组方式整
合入宿主基因组 *拷贝数：大多情况下为1个
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 细胞：带壁的完整细胞 原理：通过碱金属离子（如Li+等）、PEG和热休克处理诱 导细胞吸收外源DNA。 特点：
吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 共转化现象极为罕见
酵母菌电击转化法
细胞：带壁完整细胞或原生质体
原理：通过电脉冲对细胞膜造成DNA摄取通道
改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达
转录水平
羧肽酶Y 转录水平
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
Lys HOOC
Ubiquitin 76 aa
ubiquitin ligase E3
靶蛋白
Lys
ubiquitin ligase E3
靶蛋白
Lys
蛋白酶体
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。
酵母菌表达系统的选择
乳酸克鲁维酵母表达系统
乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源
蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也
能稳定遗传40代以上。
乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优
于酿酒酵母表达系统。
3、酿酒酵母糖基化系统
糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）