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具体操作流程及常见问题
◆ 操作流程演示
◆ 常见问题小结
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第一天
第二天
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PVDF膜酒精浸润 PBS洗涤三次 预包被可 加包被抗体过夜 以省去的 步骤 PBS洗涤三次 封闭，室温2小时 PBS洗涤三次 加入细胞和刺激物孵育过夜
无 菌 操 作
第三天
8 去除细胞，PBST4℃十分钟后洗涤三次 9 加检测抗体，室温孵育1.5小时 10 PBST洗涤三次 11 加SAP室温孵育1小时 12 PBST洗涤三次 13 加入 BCIP/NBT显色 14 计数，结果分析
1 2 3
人血分离 PBMC 方案
小鼠脾脏 淋巴细胞 分离方案
小鼠、大 鼠、兔子 血液淋巴 细胞 分离方案
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厂家
产品编号 AS1114544 AS1114545 用途 主要成分 密度 渗透压 AS1019818
产品名称 LymphoprepTM 分离液（即 用型） （也称之为淋巴细胞分离液）
规格
MABTECH ELISpot技术 应用简介
任东 莱兹技术部
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ELISpot原理、优势及应用
主 要 内 容
具体操作步骤 常见问题总结
技术的改进
参考文献
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Mabtech 公司是世界首家研发和生产ELISpot 试 剂盒的公司，为广大科研和临床用户提供稳定的 高质量的产品，包括人类、非人灵长类、大鼠、 小鼠等种属的T淋巴细胞因子和B细胞分泌抗体检 测产品，其中非人灵长类试剂盒是科研人员首选 之品。
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爱恨交加的 血清培养基
血清这一生物制品，含有 许多未知成分，以及受着 动物个体差异的影响
实验需要血清
细胞孵育离 不开血清 实验要避开 血清干扰
血清干扰ELISPOT
改进：只取血清中维持淋巴细胞生长所需要 的必须成分，去除其他杂质做成培养基
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细胞培养基 的改进 原理即，将血清中对淋巴细胞维持所必需的成 分（包括营养代谢成分、细胞信号成分和多种生长因 子），把它们做成原料，添加到空白培养基中。然后 需要反复验证这些添加成分，保证它们能够满足以下 三个要求：
洗涤时间和次数不 够，导致背景过深。
洗涤时间和次数比较合适， 背景容易分辨斑点。
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3
细胞和刺激物的浓度
细胞浓度通常为2～5×105cells/well，刺激物浓 度10～50ug/mL，依据实际情况摸索形成最适密度 的单细胞层分泌合适的斑点数。
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包被抗体的量
包被抗体的质量和浓度与斑点的大小形态很有 关系，如下图，随着包被抗体浓度的增加斑点变得 清晰致密。
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◆ 悬浮在ELISpot板膜上的细胞，它
分泌细胞因子是没有方向性的，均匀 地向四面八方扩散，其中路径越短， 扩散中耗散损失就越少，到达该点的 细胞因子就越多，将来显色的时候颜 色就越深。
◆不同的细胞，对不同的刺激物，不
同的细胞因子，ELISpot斑点的直径 （平均直径）也不同，如果一次实验 中有两类细胞同时受到刺激，比如T 细胞与巨噬细胞，或者一次实验中T 细胞受到两种不同的刺激物刺激，比 如蛋白抗原与内毒素（大肠杆菌表达 的蛋白很可能含有较高浓度的内毒 素），那么同一个孔中就会出现两种 不同的斑点。
价格
Axis-shield 专一型分离液
用途
主要成分 密度 渗透压
1x250 ml ￥590 4x250 ￥1,800 ml 分 离 人外 周血 单个 核细 胞 PBMC ， 250ml 可 分离 250ml全血 Sodium diatrizoate (离子碘化物) 和多聚糖（黏性 相对较高） 1.077±0.001l g/mL(20 º C) 290±15mOsm 18Tube LymphoprepTM 分离管（即 s ￥1,350 用型） x10ml 分离人外周血单个核细胞PBMC，每管可分离10ml 全血 泛影葡胺钠(Sodium diatrizoate) 和多聚糖（黏性 相对较高） 1.077±0.001l g/mL(20 º C) 290±15mOsm
0.2ug/well
0.5ug/well
1.0ug/well
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5
细胞、刺激物加样
要领为：先加刺激物（悬空滴加），然后悬在
孔的正上方，逐滴滴加细胞悬液(自然滴下)，此过 程中要避免产生气泡以及剧烈晃动培养板。这样细 胞就能依靠扩散的原理，均匀的分布在孔板内，避 免了贴壁细胞产生。
注意：一定不要拍击板子来 让细胞混匀，那样会适得其 反。
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ELISPOT的优势
高通量检 测 灵敏度高 功能性检测 单细胞 水平
只要阳性细胞频率大于 4 个/60 万细胞，就可 以被ELISpot检测出来。 这算出来的实际灵敏度 为十五万分之一。
直观， 可信度高
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ELISpot 技术的应用领域
移植中排斥反应的预测和监测。 疫苗研发和机制研究。 Th1/Th2极化的分析和研究。 自身免疫病研究。 肿瘤致病机制和治疗药物的研究和开发。 变态反应性疾病等自身免疫病研究。 感染性疾病的治疗和研究。
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离心之后的 PBMC沉淀
PBMC计数
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准备5%CO2 37℃培养箱培养
＊适当浓度的抗原
（10-50μg/ml）
＊适当浓度的细胞悬
液（2～5×105/孔）
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BCIP/NBT底物
细胞因子单克隆抗 体
生物素化检 测Ab
抗生物素ALP
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室温下显色2-10分钟
室温避光过 夜晾干之后，读 板，或者晾干避 光保存。
厂家
产品编号 AS1114542 用途
产品名称
规格
价格
主要成分 密度 渗透压 AS1106865 用途 Axis-shield 全能型分离液 主要成分 密度 渗透压 AS1002424 用途
主要成分
OptiPrepTM 分离液（即用型） 1x250ml ￥1,240 最新型全能型分离液：可多种细胞，如分离人/哺乳 动物 PBMC ，也可分离单核细胞，多型核细胞、 DC 、 肝星状细胞、精子等；也可分离亚细胞器，如线粒 体、核糖体、溶酶体、核等；也可分离生物大分子， 如脂蛋白、蛋白、质粒DNA以及微生物等。 Iodixanol（非离子碘化物、低渗、低黏性、无毒） 1.320±0.001g/mL(20 º C) 170±15mOsm NycoPrepTM Universal 分离液 1x300ml ￥1,425 （即用型） 全能型分离液：可多种细胞，如分离人 / 哺乳动物 PBMC ，也可分离单核细胞，多型核细胞、 DC 、肝 星状细胞等；也可分离亚细胞器，如线粒体、核糖 体、溶酶体、核等；也可分离生物大分子，如脂蛋 白、蛋白、质粒DNA以及微生物等。 Nycodenz （ 非 离 子 碘 化 物 、 无 毒 ， 密 度 高 于 1.26g/ml时轻微高渗） 1.310±0.001g/mL(20 º C) 580±15 mOsm 1x500g ￥3,580 Nycodenz 粉剂 全能型分离液：可多种细胞，如分离人 / 哺乳动物 PBMC ，也可分离单核细胞，多型核细胞、 DC 、肝 星状细胞等；也可分离亚细胞器，如线粒体、核糖 体、溶酶体、核等；也可分离生物大分子，如脂蛋 白、蛋白、质粒DNA以及微生物等。 Nycodenz （ 非 离 子 碘 化 物 、 无 毒 ， 密 度 高 42于 1.26g/ml时轻微高渗）
ICE Peptide Pool 2x105 hu-PBMC indirect
tetanus 105 hu-PBMC indirect
ConA 2.5x104 hu-PBMC indirect
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培养基的改进
淋巴细胞 分离技术
ELISPOT 技术改进
淋巴细胞
冻存、复
苏技术
的改进
的改进
Reader的改进
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拍击后细胞的贴壁实例
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细胞的培养
1
2
培养过程中避免培养板的剧烈震动，以免形 成“拖尾”现象（图1）。但是如果大部分斑点 形态正常，只有少数有此现象时多数是因为DC 31 趋化所致（图2）。
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斑点的出现空斑
主要原因：粒细 胞分泌或分解所致的
酶解现象。
可以通过采用多
价刺激物，以及提高
PBMC的分离质量来改 善。
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原理
酶联免疫斑点检测（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay, ELISpot），从字面
上来说，可以分解成两部分：“酶联免疫” 与 “斑点”。
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ELISA
ELISPOT
抗体捕获的抗原来自于样品细 胞在检测的当时新鲜分泌的抗原 分子
酶 联 免 疫 斑 点
抗体捕获的抗原来自样品 溶液中的已经存在的、均匀 分布的抗原分子
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CDC的采集的一个实例： （透明板，PBMC，乙肝核心抗原蛋白）
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显色时机的把握 显色时间一般控制在2～
10分钟，要依斑点的形成情
况适时终止显色。
显色反应和温度有很大的
关系，如果室温很低（如冬
季），可以适当延长显色的时
间。
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技术的改进
PMA/ionomycin 2.5x104 hu-PBMC indirect
抗原决定簇图谱分析。
化合物和药物免疫学反应的筛选等。
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中国药品生物制品检定所： 2003年 《预防用DNA疫苗临 床前研究技术指导原则》《预防用以病毒为载体的活疫苗 制剂的技术指标原则》“使用ELISPOT方法检测淋巴细胞 分泌γ干扰素功能，应该作为检测和评价疫苗的细胞免疫的 有效方法” WHO：WHO-UNAIDS-sponsored training workshop 2003年 在艾滋病(HIV)疫苗的研究中，推荐使用ELISPOT 检测淋巴细胞分泌γ干扰素功能。 卫生部文件（【2012】6号）：增补结核感染T细胞检测 （免疫斑点法）等临床检验项目。