2）用D-缬氨酸代替培养基中L-缬氨酸
2 小胶质细胞的污染：预震荡的方法可以驱除大部分小 胶质细胞，或者在培养液加入 5mmol/l的L-亮氨酸甲酯， 两小时后可杀死小胶质细胞。 3 少突神经胶质细胞的污染：1 ）含血清培养； 2）在 传代培养时用抗半乳糖脑苷脂抗血清或补体处理
GFAP
human Schwann cells
培养的方法：
1）取材 生后1天的大鼠，75%酒精消毒， 断头，置于培养皿中
2）沿纵轴剪开皮肤和颅腔，取出大脑皮 质，去除嗅球等
3 去除脑膜，洗涤 （Hanks液） 4） 组织剪成碎块，37℃缓慢振荡约10 min。 5）重复过滤数次，收集细胞悬液，调整细胞 密度104~106/cm2接种于培养瓶，常规CO2孵 育箱培养
Na2HPO4.2H2O KH2PO4 NaHCO3 葡萄糖 酚红 0．20
1．14 0．06 3．20 1．00 0．02 0．35 1．00 0．02
2．42 0．20 0．06 0．35
0．02
0．02
第 二节：神经细胞体外培 养的 基本概念和方案
• 神经细胞培养的类型 1 神经细胞的原代培养
缺点：1）仅能获得Ⅰ型胶质细胞
2） 成纤维细胞增殖能力更强 3）部分Ⅰ型胶质细胞体积变大 2 利用抗原和抗体结合原理用流式细胞仪分选获 得
3 小胶质细胞在营养剥夺的情况下可以生长良好
污染细胞的去除
1 成纤维细胞的污染：为Ⅰ型星型胶质细胞主要污染细 胞（用抗纤维结合素（fibronection)的抗体鉴别） 1）预防为主；取材小于两天鼠，脑膜驱除干净，
3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生 长于无污染及无毒的环境！！ 无毒：与细胞直接接触者—培养器皿、 底物、培养基，蒸馏水等； 间接接触者—配制培养基的器皿、 瓶盖、瓶塞等 无污染： 微生物及交叉污染
6 常用的培养用液及培养基
• 培养用液：水
平衡盐溶液（ＢＳＳ）（见表） 消化液１胰蛋白酶液（０．２５%） ２ 二乙烯四乙酸二钠（ＥＤＴＡ） ３胶原酶
原代培养（primary culture)：指从活体获得细胞、 组织或器官在体外条件下进行的第一次培养 传代培养(subculture)：当细胞持续生长到达一定密 度之后，就应当将细胞分成两部分（或更多）至新 的培养器皿并补充新的培养液为传代培养。
2 细胞系培养
一 神经元的原代培养(Primary culture)
+
— + + —
—
— + +
—
+ + + —
125I-CYP
NG2 J1 Ia
Β-肾上腺能受体
300kDa蛋白聚糖 细胞黏附分子 Ⅱ型MHC抗原
+
— — + +
—
+ + +
—
+ + — —
利用细胞培养可研究胶质细胞 的特性
受体的表达 神经营养因子的分泌 酶的诱导、蛋白质的合成 神经递质的摄取
髓鞘的形成
c 首次传代时细胞数量要多一些，使 细胞尽快适应新环境
鉴定：星形胶质细胞鉴定： 胶质原纤维酸性蛋白 （Glial fibrillary acid protein GFAP， A2B5） 少突胶质细胞 鉴定：GalC（ß -galactosidase)
第0-12天 大鼠脑皮质混合细胞培养
第12天 预震荡（260rpm，1.5h）收获非贴壁细胞
MAP-2
A
B
NSE stain neuron
TH stain neuron
Confocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus
N
Slice culture. Lucifer yellow stain (bar 50µ m)
五、神经元的纯化：
胞嘧啶阿拉伯糖 ，培养两至四天后用含5~10 mol/L 胞嘧啶阿拉伯糖的培养24 hour ,然后改用常规培养液。
培养过程中注意事项
1） 培养底物的处理： 多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸
细胞外基质成分（胶原） 细胞黏附分子
单层非神经细胞 单层的胶质细胞
2） 胰蛋白酶的作用时间： 3）细胞合适的换液时间：大脑皮质 不用经常换液 海马神经元应半量换液 胶质细胞经常换液
三、培养操作过程
• 新生1～3d SD大鼠，麻醉后75%酒精浸泡消毒，断头后移入超净
工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于D-Hanks液中，仔细剥 除脑膜和血管，小心剥离脑组织（海马），放入10ml小瓶中 •剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37℃培养箱，定期振摇促消化。消 化约20min， •用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔吹打，用200目 不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制成细胞悬液，1000rpm/min离心、 洗细胞两次，每次10min，
•吸收少许细胞悬液，用血球记数板快速计数细胞数，
•用含10%胎牛血清的DMEM培养基，稀释细胞制成1×106/ml细胞悬 液，接种于经多聚赖氨酸处理过的24孔培养板或培养瓶内（板孔放 置0.8х 0.8cm的小盖玻片），放入5%CO2培养箱，37℃培养。
四、神经元的鉴定：
神经元特异性烯醇化酶（ Neuron specific enolose NSE）、 微管相关蛋白（Microtubule associated protein MAP2） ——神经元,
4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数）
b 悬浮生长型细胞（少数）
2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性
5 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子； b 营养因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类 为35~37℃；鸟类为38.5℃ b 气相及PH 值 ：O2及 CO2的值： CO2=5%；PH=7.2~7.4 c 渗透压：260~320m mol/L
NaCl KCl CaCl2 MgCl .6H2O MgSO4.7H2O Na2HPO4.H2O
9．00 0．42 0．25
8．00 0．20
6．80 0．40 0．20
8．00 0．40 0．14
8．00 0．20 1．10 0．10
8．00 0．40
0．20 1．56
0．20 0．06 0．06
3) 聚L -赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10 min
4) 神经营养因子： 睫状神经营养因子（ ciliary neurotrophic factor, CNTF): 支持交感神经、副交感神 经和感觉神经的生长与存活； 脑源性神经营养因子 （brain derived neurotrophic factor ,BDNF):支持外周 和中枢特殊细胞群体的神经细胞； 硷性成纤维生长 因子（basic fibroblast growth factor, bFGF ) 等
缺点：不能表现出神经元分化的许多过程，
不能植入人体。
神经细胞系的建立： 1）动物诱发性神经肿瘤分离细胞进行培养 （PC12） 2）将连续细胞系的细胞与神经系统特殊区域分 离的细胞融合。
3）利用含有癌基因的逆转录病毒感染神经细胞， 使神经细胞获得永生。
Neuroblastoma cells on glass slide
运动神经元 Dil标记
Purkinje cell in culture (PEP-19)
二、胶质细胞的培养
胶质细胞 纤维性 的分类：a大胶质细胞— 星形胶质细胞 原浆性
少突胶质细胞
b小胶质细胞 周围神经系统主要是施万细胞
研究胶质细胞的方法
1） 从未成熟的脑组织分离、培养获得 大量胶质细胞 2）已经开发出能识别胶质细胞的免疫学 标志物。
三、神经细胞系培养
细胞系的生长过程： 有限细胞系：原代培养 无限细胞系：滞留期 传代期 衰退期 平台期
指数增长期
２０ 原 代 培 养
１８
指 数 细 胞 数 量
细胞系阶段
１６
无限细胞系
系
８
６
０ ２
４
６
８
１０
１２
２４
３４
４４
培养时间（周）
神经肿瘤细胞系培养
优点：
容易生长、增殖速度快、实验操作简单等优点； 可以用液氮长期保存； 培养条件标准化； 可以导入外源基因；
一、组织来源： 1） 种属： 大鼠 小鼠 家鸡 瓜蟾 海兔 蜗牛 水蛭 等
2）年龄：一般为胚胎或新生动物组织
神经胶质细胞：生后早期 蒲肯野细胞 ：胚胎末期 颗粒细胞： 生后两周以内 主要根据轴突和树突广泛分枝发育之前培养
二、常用试剂
1） 培养液 A DMEM ： B F12 培养液 C DMEM/F12 培养液 D 无血清培养液加神经营养因子 2） D-Hank`液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（ HBSS）
• 培养基：天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解
乳蛋白） 合成培养基（ＭＥＭ ＤＭＥＭ ＨＡＭ`S F12 ＲＰＭＩ（１６４０） １９９ Ｌ－１５ ）等
常用的平衡盐溶液（g/L）
Ringer (1985) PBS Eargle (1948) Hanks (1949 Dulbecco (1954) D-Hanks
根据免疫组化反应分类：
Ⅰ型星型胶质细胞和Ⅱ型星型胶质细胞：
标志物 检测对象 Ⅰ型 形态 A2B5 GFAP 多聚唾液酸神经节苷脂 胶质纤维酸性蛋白 多角型 — + 细胞类型 Ⅱ型 星型 + + 少突胶质细胞 具有少量突起 + — —
Ran-2