细胞器的分离、制备与观察
[目的要求]
1．掌握差速离心法的原理。

2．了解甲基绿-派洛宁、中性红-詹姆斯绿的染色原理和着色现象。

3. 掌握细胞核、线粒体等细胞器的染色方法。

[实验原理]
球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质黏度和离心力。

差速离心法（differential centrifugation）是将细胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心，较大颗粒先在低速离心时沉淀，再用高速离心上清液中的小颗粒物质，从而达到逐级分离细胞器的目的。

细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、分级分离和分析三个步骤完成。

分级分离方法有两种，即：差速离心法和密度梯度离心法。

细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和替他微体、核糖体和大分子物质。

线粒体内膜上分布细胞色素氧化酶，能使詹纳斯绿B燃料保持在氧化状态呈现蓝绿色，而胞质中的颜料被还原成无色。

[实验用品]
1．器具：匀浆器、高速冷冻离心机、天平、普通光学显微镜、1.5 ml Ep管、载玻片、10 ml滴管、冰盒、冰块、滤网、染缸、20 ml烧杯。

2．材料：动物肝脏。

3．试剂：生理盐水、PBS、0.25 mol/L的蔗糖溶液、0.34mol/L的蔗糖溶液、0.88mol/L 的蔗糖溶液、95%乙醇、丙酮、甲基绿—派洛宁、中性红—詹纳斯绿、蒸馏水、冰。

4. 甲基绿-派洛宁染液：0.2mol/L醋酸缓冲液(pH4.8)：冰醋酸1.2ml，加蒸馏水至100ml；醋酸钠2.72g溶于100ml蒸馏水中; 使用时两液按2：3比例混合.
A液：5%派洛宁水溶液4ml、2%甲基绿水溶液14ml、蒸馏水16ml；B液：0.2mol/L。

醋酸缓冲液(pH4.8)16ml。

使用时临时将A液与B液混合(5:2)。

5．）中性红-詹纳斯绿B染液： A: 将3滴詹纳斯绿B饱和水溶液(溶解度5.18％)加到5ml无水乙醇中，然后再加入1ml 1:15000中性红溶液(中性红10mg溶于
150ml水中)，瓶子用黑纸包好，4℃冰箱保存。

[实验步骤]
1．组织匀浆制备
肝脏用预冷的生理盐水洗净血污，用滤纸吸干。

称取约1 g左右的肝组织，用预冷的0.25 mol/L的蔗糖溶液冲洗数次，剪碎。

以预冷的0.25 mol/L的蔗糖溶液4.5ml悬浮剪碎的组织，移入匀浆器内，在冰浴条件下匀浆（蔗糖溶液分数次加入）。

（0.25 mol/L的蔗糖溶液使肝脏细胞在匀浆的过程中处于低渗条件下，使得细胞更容易破碎，匀浆彻底）
2.细胞器的分级分离
2.1细胞核的分离：
将组织匀浆分装到1.5ml 离心管中，3000rpm,离心10min，沉淀为细胞核及质膜碎片。

（上清液留作线粒体分离）
2.2沉淀用1ml0.25mol/L蔗糖溶液洗涤离心2次，每次4000r/min离心10min；
2.3将沉淀用500μL0.34mol/L蔗糖溶液悬浮，然后在悬液下轻轻加入0.88mol/L蔗糖溶液400μL，尽量使溶液分层，5000r/min离心15-20min；
2.4用PBS溶液悬浮——涂片——干燥——95%乙醇固定（5min）——甲基绿-派洛宁染色15-20min——放入丙酮分离30S——蒸馏水漂洗——吸干镜检。

(2)线粒体的分离
将分离细胞核时收集的上清以10000g 离心10 min，弃去上清。

沉淀用预冷的0.25 mol/L的蔗糖溶液1ml重悬后，10000g 离心10 min，取沉淀。

(3)线粒体的鉴定
于洁净载玻片上滴1滴中性红-詹纳斯绿B染液，用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中，染色5-10 min，盖上盖玻片，镜检。

[结果与分析]
光学显微镜下观察，可看到富集分离的细胞核，细胞核呈圆球形，核中央可见到两个或多个被染成红色的核仁，外围的物质被染成蓝绿色；线粒体经詹纳斯绿B 染色呈蓝绿色，呈棒状或哑铃状。

[注意事项]
1．组织匀浆时，既要尽可能使细胞完全破碎，又要尽量快速。

2．在细胞器分离过程中，所有操作应尽可能在低温下进行。

3．实验过程应注意保持细胞器的完整性，避免操作过于剧烈。

[思考题]
1．简述细胞器分级分离的实验原理和主要步骤？
2．实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得细胞器的含量和纯度？。