细胞工程实验报告专业一、实验目的1、了解动物细胞培养的相关实验器材以及实验前器材的清洗与消毒、无菌室灭菌与消毒等基本方法，以建立起无菌操作的概念。

2345678二、实验原理1、原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后直到第一次传代为止。

原代培养首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织或器官，切成一定大小的组织块，直接或经消化分散成单个游离的细胞，在人工培养条件下，使其不断地生长、繁殖。

2、细胞活性测定——MTT法MTT法是利用细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶四氮唑蓝还原成难溶的蓝紫色结晶——甲瓒，经二甲基亚砜（DMSO）溶解后，在490nm处测吸收值，其吸收值可间接反映细胞的活性状态及活细胞数量。

3、培养细胞的超低温冻存于复苏45、免疫脾细胞的制备小鼠经抗原多次免疫后，可从脾脏组织细胞分裂和分化出较多能分泌相应抗体的B淋巴细胞，脾脏内细胞连接不紧密可通过机械分离和过滤网筛选，将这些细胞制备成游离的单个细胞悬液。

6、杂交瘤细胞的制备（细胞融合）通过对免疫动物B细胞和某一个永久细胞系进行融合，杂交后代称之为杂交瘤。

杂交瘤细胞可以将分泌特异性抗体B细胞的遗传特性和骨髓瘤细胞系体外增殖的遗传特性合二为一。

一种淋巴细胞克隆只产生一种特异性抗体；细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持亲代双方的特性；杂交瘤细胞的筛选，体外培养大量增殖，获得所需抗体。

7、产物的1231，倒入小时后方可进入操作。

培养器材的消毒：干热灭菌法：玻璃器皿、金属器具等的消毒方法，140～150℃，2～3小时；湿热灭菌法：橡胶制品、无菌衣、帽和口罩以及除菌过滤器的清毒，高压蒸汽灭菌15磅20—30分钟；紫外线照射灭菌：多孔培养板的灭菌－30分钟。

抽滤除菌：培养基等（培养基通过0.22过滤装置－除菌）2）杂交瘤技术与单克隆抗体制备1、小鼠的免疫方法：脾脏直接注射：一般免疫后3～4天即可制备抗体。

? 其它途径注射：一般采用间隔免疫的方法，分3次，间隔2～3周进行免疫。

步骤：取绵羊静脉血0.2mL（加肝素或枸橼酸钠抗凝）? 用0.9％NaCl或PBS 1000~ 1500rpm离心5分钟涤洗3次，收集血细胞。

710个/小格）天，?。

一个=细胞数/2取五只没有免疫过的小鼠---每只小鼠眼球取血0.5mL以上于1mLEP管中----小鼠短颈处死后，放于装有75%酒精的烧杯中消毒灭菌，带入无菌室备用——取出血清放于37℃水浴保温30min——2000转离心10min——取上清于干净的离心管中，作为ELISA的阴性对照取五只免疫过的小鼠——同上操作——取血清作为ELISA的阳性对照3、单克隆抗体的制备流程4、骨髓瘤细胞的培养1、选择生长旺盛，形态良好的细胞?2、将上清倒入离心管内，剩余贴壁的细胞用0.02％EDTA消化液消化细胞5分钟后倒入同一离心管，1000～1500rpm离心5分钟，收集细胞。

?3、加5％51? 21640? 3? 4，取51.2.3.用一次性注射器将脾脏刺几个洞，再吸3～4mLPBS液吹打脾脏。

4.收集吹打的细胞悬液，经低速离心洗涤后将细胞悬浮在培养液。

6、杂交瘤细胞的制备（细胞融合）1.将骨髓瘤细胞(2×107）与脾细胞按1:10的比例混合，低速离心后弃上清，用手指弹匀细胞。

2.将1mL50％的PEG在1分钟内缓缓加到混合的细胞内，注意边滴加PEG边摇动离心管。

3.PEG作用1分钟后，迅速滴加培养液终止PEG作用，低速离心洗涤细胞。

4.用10mLDEME培养液悬浮融合细胞，按每孔3滴的量滴加到含滋养层的96孔板内，置37℃5％CO2培养箱中培养。

31.2.1mm33.4使组织块浸入培养液中，继续静止培养。

5．72小时后在显微镜下检查，若见细胞自组织边缘长出，则继续培养3-5日，再换部分或全部培养液，待多数组织块的生长晕相接时，可进行传代培养。

肝细胞培养的实验结果：?若培养液显为淡黄且清澈，一般显示细胞生长良好。

?培养3～5日，在相差显微镜下观察，若见细胞自组织边缘长出，更换部分或全部培养液，待多数组织块的生长晕相接，小心挑掉组织块，继续培养3～4天。

?7天左右后，生长晕扩大到直径为15mm左右小鼠肝脏细胞原代培养的生长晕是多角形上皮样细胞与梭形细胞混合的细胞群体。

?24～48小时后若培养液变成黄色且混浊，表示已被污染；?123456741.取2.pH7.6）（低渗）混匀后，常温处理20~25min，4℃12000~13000 rpm离心15min，去上清，重复一次。

3.取乳白色沉淀（血影）用包被液稀释至后，按50g（老师制备）加入96孔酶标板内，放于湿盒4℃冰箱过夜，备用。

4.吸去孔中的抗原液（自制吸头，这样冲击力会小，不会使包被的抗原脱落），用洗涤液洗涤3次（将洗涤液沿孔壁注入200?L/孔，放置3分钟，甩去洗涤液，重新注入），加封闭液（含1％牛血清白蛋白的洗涤液）200?L/孔，封闭30min。

5.甩去封闭液，用洗涤液3次。

6.待测抗体作1:500、1:1000、1:2500、1:5000稀释后，按每孔100uL加入，置湿盒内于37℃作用1小时。

同时设阴性、阳性、空白对照（调零孔）。

7.8.9.10.11.12.）5?1.?2.用，分装成3管，每管0.8ml，经以下处理后-196℃（液氮）冻存过夜。

分组：A组：直接冻存；B组：细胞悬浮在10％DMSO-1640培养液中冻存；C组：细胞先经10％浓度的玻璃化保护剂处理（PVS2），4℃过渡5min，然后 4 ℃1000rpm离心10min，弃上清，再用100％PVS2保护剂，4 ℃过渡5min后冻存；（注：为了MTT法测定细胞活性比较三种方法时减小误差，按C组平行离心AB组。

）3、MTT法测定细胞活性1.从液氮中取出冻存管，直接投入37～40℃的水浴中，并不时摇动，使其快速（1分钟之内）融化。

，弃上反应121′-1：调零孔２０００２′－５、６、７、８：１：２０００５′－１、２、３、４：１：６４０００３′－１、２、３、４：１：４０００５′－５、６、７、８：１：１２８０００８′９′１０′１１′于２′３′４′５′相同加入底物溶液（TMB）后，阳性孔呈蓝色，阴性孔无色；加入终止液后，阳性孔呈黄色，阴性孔无色。

结果（OD ）：阴性对照：０．０１６２５１：１０００：０．１３４７５（０．１９６２５）１：２０００：０．１３０５（０．１６２５）１：１２８０００／阴性对照：１．１０８（２．０１５）就结果而言：以２′３′４′５′为准：１：１６０００／阴性对照>２．１，为阳性１：３２０００／阴性对照<２．１，为阴性则效价为１：１６０００以８′９′１０′１１′为准：１：６４０００／阴性对照>２．１，为阳性１：１２８０００／阴性对照<２．１，为阴性则效价为１：６４０００实验时加液可能存在的误差或不准确，使液面有高低，影响折光率，112洗板及加样过程中，酶标受污染失活，失去催化显色剂显色的能力；培养时间及温度为达到要求；洗板次数过多，或洗涤液不符合要求，洗涤冲击力太大，浸泡时间过久；底物作用时间不够3、阴阳性对照正常，待测品未检出原因：样品高温放置过久，或反复冻溶致待测物浓度下降4、出现随机性的花板、跳板现象原因：样品离心不完全，反应孔内发生凝血或残留细胞成分；加样时交叉污染；手工洗板时造成交叉污染；5、假阳性21.不同细胞的最适冷冻速度不同，主要取决于水分渗透过程是否与降温速度相匹配；同时还取决于细胞的表面积与体积之比，以及细胞膜的渗透率。

一般来说。

小细胞(如红细胞等)对水通透性强，适用于快冻，最佳冷冻速率较高，可达103o C／min 或更高；相反大的细胞或组织，如直径100 m以上的胚胎，对水的通透性弱，则适于慢冻。

此外，最佳冷冻速度还受是否应用防冻剂、防冻剂的含量以及培养的细胞所处的状态等多方面的因素影响。

目前被普遍接受的是皮肤的低温保存中采用慢冻快复温，一般认为降温速率以1~5 o C／min为最佳。

2.复苏复温速度是指在细胞复苏时温度升高的速度。

冷冻保存体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速度、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也需要有最佳的复3.结合，同胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。

细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。

在使用该类冷冻保护剂时，需要一定时间进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。

目前使用较多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。

非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。

该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。

其保护机制的假设很多，其中一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量。

使冰点降低。

减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。