植物多糖提取、分离及检测
实验目的
学习并掌握植物多糖提取、分离及检测的原理和方法
实验原理
植物多糖（polysaccharide）是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个以上的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式（c6h10o5）n表示。

由相同的单糖组成的多糖称为多糖，如淀粉、纤维素和糖原；以没的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成。

多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。

多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。

多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖。

多糖普遍存在于自然界植物体中，其分子量一般为数万甚至数百万，是构成生命活动的四大基本物质之一，同维持生命功能密切相关。

多糖的提取分离，含色素较高的根、茎、叶、果实类需进行脱色处理，然用水、盐或稀碱水在不同温度下提取，应避免在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂。

一般植物多糖提取多采用热水浸提法，所得多糖提取液可直接或离心除去不溶物。

在多糖的检测方面采用单糖衍生物的GC/ MS 分析可以对多糖中的具体结构进行定性分析。

实验材料
材料山茶叶片
仪器组织粉碎机、烘箱、超声波提取机、恒温水浴锅、索氏提取器、旋转蒸发仪、冰箱、离心机、分液漏斗、GC/ MS 分析仪
试剂活性炭、95%乙醇、Sevag 试剂、无水乙醇、丙酮、无水乙醚、2mol·L - 1的硫酸、BaCO3 粉末、盐酸羟胺、吡啶、乙酸酐、氯仿
实验步骤
1、多糖提取分离称取粉碎、干燥好的山茶叶150g ,加入1500mL 蒸馏水,超声波提取20min ,于90 ℃恒温浸泡2h ,提取两次;得棕色滤液, 用活性炭对其脱色，活性炭量为活性炭：溶液=0.5%。

过滤脱色后的滤液用旋转蒸发仪浓缩至50mL ,抽滤,加入200mL 95 %乙醇沉淀多糖,于冰箱醇析24h ,得棕色絮状物,离心,收集沉淀。

Sevag 法去蛋白Sevag 试剂的配制:用氯仿与正丁醇以4∶1 混合。

取上述粗多糖加水溶解,于溶液中加入溶液1/ 3 倍体积的Sevage 试剂,剧烈震荡至无白色絮状物析出,离心15min ,除去水相与有机相交界处的变性蛋白,Sevage 法脱蛋白重复3 次。

剩余液体加入200mL 无水乙醇,充分振荡摇匀,于冰箱静置24h ,得棕色絮状物,离心收集沉淀。

沉淀经无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤两次,干燥,得棕色多糖211g。

2 、多糖的检测
（1）、多糖水解称取50mg 山茶叶多糖,加入浓度为2mol·L - 1的硫酸10mL ,封管,超声振荡3～5min 至多糖完全溶解后,在100 ℃恒温水浴振荡水解2h ,然后将试管置于烘箱中于110 ℃反应6h。

反应完成后冷却至室温,加BaCO3 粉末中和至中性, 离心, 过滤, 真空干燥, 得到水解后的单糖混合物10.5mg。

（2）糖腈乙酸酯衍生物的制备称取10mg 单糖样品和10mg 盐酸羟胺,用20mL 吡啶溶解,封管,95 ℃恒温水浴振荡30min 后冷却至室温;加入016mL 乙酸酐,封管,95 ℃恒温水浴振荡30min ,反应完成后冷却至室温,得糖腈乙酸酯衍生物。

加入2mL 蒸馏水破坏乙酸酐,氯仿萃取,待测。

（3）单糖衍生物的GC/ MS 分析色谱条件:RTX25 石英毛细管柱(30m ×0125mm ×0125μm) ;载气为高纯氦气。

柱箱初始温度100 ℃,进样口温度240 ℃,流速0166mL·min - 1 ,分流比30∶1 ,进样量1μL 。

程序升温:初始温度为100 ℃,以10 ℃·min - 1升至250 ℃,保持1min。

（4）质谱条件:离子源为EI 源,灯丝电流016mA ,离子源温度200 ℃,电离能量70eV ,接口温度250 ℃,电子倍增管电压1120kV ,扫描周期015s ,扫描范围30100～400100m/ z ,溶剂延迟3min。