5.酶联免疫染色 5.酶联免疫染色
• 室温，用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min，缓冲液 室温，用缓冲液Ⅰ min， min，再用缓冲液Ⅰ Ⅱ洗膜 30 min，再用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min。 min。 • 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000）， 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（ 2000）， 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。 4℃只能稳定 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。室 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 • 缓冲液Ⅱ洗膜2次，每次15 min，以除去未 缓冲液Ⅱ洗膜2 每次15 min， 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液 缓冲液Ⅲ 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液Ⅲ平 衡膜2 min。 衡膜2-5 min。
• Northern 杂交是用于RNA定量和定性分析的常用 杂交是用于RNA RNA定量和定性分析的常用 技术，它是将RNA RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 技术，它是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上， 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核 酸分子杂交的一种实验方法。 酸分子杂交的一种实验方法。 • 可以鉴定总RNA或poly(A)+RNA样品中同源RNA的存 可以鉴定总RNA RNA或 RNA样品中同源RNA的存 样品中同源RNA 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， mRNA分子的大小和丰度 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， 是分子生物学中研究基因表达在转录水平上的调 节以及cDNA合成的重要手段。 节以及cDNA合成的重要手段。 cDNA合成的重要手段
浸泡在 250 ml tris*NaCI 室温、 室温、30r/min 30min。 。
浸泡在250ml 浸泡在 10*SSC约 10*SSC约1min 。
RNA转膜前Βιβλιοθήκη 处理 RNA转膜前的处理毛细管洗脱法 转膜的 方法 真空转移法 电印迹法
叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡， 叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡，转膜约 10 h。
室温 3h
75° 75°C 保温10 保温10 Min。 Min。
1000r/min 15min、 15min、 去上清 加预冷 、乙醇洗 -20 无水乙 涤、真 醇、混 ℃、 空干燥 匀。 TE溶解 2 h 、TE溶解 20° 、-20°C 备用。 备用。
4.杂交 4.杂交
• 将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按 将待杂交的滤膜放入杂交袋中， 滤膜计算加入预杂交液、 20mL/100cm2滤膜计算加入预杂交液、 68℃水浴摇床杂交 水浴摇床杂交1 h。 68℃水浴摇床杂交1-2 h。 • 将标记好的DNA探针煮沸5min，迅速在 将标记好的DNA探针煮沸5min DNA探针煮沸5min， 冰上冷却。 冰上冷却。将探针加入预热的杂交液 充分混匀。 中，充分混匀。
northern 印迹杂交流程图
所用材料、 所用材料、试剂及仪器 方 法 与 步 骤 参考书籍及文献
材料
总RNA样品或mRNA样品、 探针模板DNA、随机引物、地高辛dUTP、klenow酶、硝酸纤维素虑膜 等。
试剂
• 10*MOPS缓冲液、DEPC水、6*RNA上样 缓冲液、37%甲醛、甲酰胺、 20*ssc(pH7.0) 杂交缓冲液、2*洗膜缓冲液 (2*ssc)、预杂交液、杂交缓冲液、缓冲液 Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ、NBT(硝基四氮唑蓝 )、 BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐) 、TE缓冲液、 显色液、琼脂糖等。
分子生物学方法之
Northern 印迹杂交技 术
原
理
• 核酸分子杂交（molecular 核酸分子杂交（ hybridization）： ）：利用不同来源但互补配 hybridization）：利用不同来源但互补配 对的核酸单链之间(包括DNA DNA,DNA-RNA， DNA对的核酸单链之间(包括DNA-DNA,DNA-RNA， RNA-RNA)能够特异性结合形成杂合双链的 RNA-RNA)能够特异性结合形成杂合双链的 特性， 特性，从而对目的核酸分子进行定性和定 量分析的技术。 量分析的技术。 • Northern Blotting: 检测RNA 检测RNA
上样
用标尺测量加样 孔与条带的距离 ，拍照
切去凝胶一角，用 用SSC冲洗并浸泡 胶板，以除去甲醛 。
电泳：用1*MOPS缓冲液 ，先用20V使样品进胶， 再用5V/cm电泳1 h ，停 止电泳。
2.转膜 2.转膜
浸泡在250 ml 50 浸泡在 Mmol/l NaOH ,室 室 温、30r/min 30 min。
仪器
• 恒温水浴箱，电泳仪，杂交袋，真空转移 仪，真空泵，杂交炉，恒温摇床，脱色摇 床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液 器，电炉（或微波炉），离心机，烧杯， 量筒，三角瓶，紫外灯等。
1.RNA电泳 1.RNA电泳
琼脂糖与纯水一定 比例于微波炉内混 匀、冷却到75°C 加mops缓冲液、 甲醛，混匀。 制备成电泳用胶 待胶凝过程中， 准备RNA样品。
室温转移10 10—25h 电泳后的凝胶 → 放置 → 室温转移10 25h → 漂洗（SSC）除碎胶片 →80℃烘烤2h固定 漂洗（SSC） 80℃烘烤2h固定 烘烤2h 核酸. 核酸.
3、探针标记
探针模 模板、 模板、随 机引物 、双蒸 水。 冰块 离心、 离心、 混匀。 混匀。 变性
顺序加 随机引 缓冲液 、dNTP 、dUTP Klenow 酶，混 匀。
• 在黑暗条件下将膜与显色液放入密封 的暗盒中显色。 min后出现颜 的暗盒中显色。通常 2 min后出现颜 充分显色应在16 h以上 以上。 色，充分显色应在16 h以上。膜可以 在弱光下短时间暴露以检测显色强度。 在弱光下短时间暴露以检测显色强度。 • 显色完毕后用TE缓冲液停止染色，照 显色完毕后用TE缓冲液停止染色， TE缓冲液停止染色 相记录显色结果。 相记录显色结果。
结 果 示 例
参考书籍及文献
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• 倒去预杂交液，按250mL/c㎡滤膜计算 倒去预杂交液， 250mL/c㎡ 向杂交袋中加入含地高辛标记探针的 杂交液，68℃杂交 h以上 杂交6 以上。 杂交液，68℃杂交6 h以上。 • 洗膜：在室温下用50mL 2*SSC，0.1% 洗膜：在室温下用50mL 2*SSC， 溶液洗膜两次以上， min。 SDS 溶液洗膜两次以上，每次 5 min。 膜即可以立即用于显色检测或储存备 干燥环境中）。 用（干燥环境中）。