Chapter I Introduction1)什么是基因？基因有哪些主要特点？基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。

①不同基因具有相同的物质基础.②基因是可以切割的。

③基因是可以转移的。

④多肽与基因之间存在对应关系。

⑤遗传密码是通用的。

⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。

2)翻译并解释下列名词genetic engineering遗传工程gene engineering基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。

gene manipulation基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。

recombinant DNA technique重组DNA技术gene cloning基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。

molecular cloning分子克隆3)什么是基因工程？简述基因工程的基本过程？p2 p44)简述基因工程研究的主要内容？p55)简述基因工程诞生理论基础p2和技术准备有哪些p3？6)基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？否，密码子简并性7)举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。

医学:人胰岛素和疫苗农业:抗虫BT农药工业:工程酿酒酵母Chapter ⅡThe tools of trade1)什么是限制性核酸内切酶？简述其主要类型和特点？是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。

类型特点p112)II型核酸内切酶的基本特点有哪些p12-14？简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些p14？3)解释限制酶的信号活性？抑制星号活性的方法有哪些？4)什么是DNA连接酶p15？有哪几类p16？有何不同p16？5)什么叫同尾酶、同裂酶p12？在基因工程中有何应用价值？同裂酶：识别位点、切割位点均相同，来源不同。

在载体构建方面往往可以取得巧妙的应用。

应用较多的同裂酶比如Sma1和Xma1，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末同尾酶：来源各异，识别序列各不相同，但切割后产生相同的粘性末端。

由同尾酶(isocaudomer)产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。

6)什么是DNA聚合酶？根据DNA聚合酶使用的模板不同，可将其分为哪两类？各有什么活性？p17-18聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3‘-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。

①依赖于DNA的DNA聚合酶②依赖于RNA的DNA聚合酶7)Taq DNA聚合酶：是一种从水生嗜热菌中分离得到的一种耐热的dna聚合酶，具有5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性，在分子中主要用于PCR。

逆转录酶：RNA指导的DNA聚合酶，8)Klenow片段的特性和用途有哪些？举例说明。

p179)名词解释：S1核酸酶、核酸外切酶、磷酸化酶激酶、甲基化酶10)什么是末端脱氧核苷酸转移酶？举例说明其应用之一。

P19加p11)什么是碱性磷酸酶？其在基因工程领域中有哪些用途？p19减p12)质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？目的基因片段与载体由相同的单一限制性核酸内切酶消化酶切后，两者的两端均具有相同的黏性末端，成为单酶切位点的黏性末端。

①为了防止载体的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体的粘性末端的5‘p以抑制DNA的自我环化。

②若构建表达载体选用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组，以便定向克隆。

13)gap缺口和nick裂口的区别？14)用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？15)哪些酶可用于DNA片段的末端标记？KlenowDNA聚合酶和T4或T7DNA聚合酶在对DNA片段进行末端补平反应或末端的置换反应时可引入标记的核苷酸。

Chapter ⅢHost and vectors1)根据来源和性质不同，可将基因工程载体分为哪些种类？质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、人工染色体2)什么是克隆质粒载体？什么是表达质粒载体？什么是穿梭质粒载体？克隆载体是指专用于基因或DNA片段无性繁殖的质粒载体。

表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。

穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。

3)基因工程中对载体的基本要求?①具有复制子，能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制。

②具有合适的限制性内切酶位点。

③具有合适的选择标基因。

④具有较多的拷贝数，易于宿主细胞的染色体DNA分开，便于分离提纯。

⑤具有较小的相对分子质量，易于操作。

4)什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？质粒是染色体外能自我复制的小型DNA分子。

严紧型和松弛型。

①不亲和性②转移性5)质粒存在的三种形式是什么？①共价闭合环状DNA②开环DNA③线性DNA6)解释质粒的不亲和性和转移性？不亲和性：两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存。

转移性：质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。

接合型质粒和非接合型质粒。

7)接合性质粒和非接合性质粒有何区别？接合型质粒：相对分子量大，除了携带自我复制遗传信息外，还带有一套控制细菌和质粒接合转移的基因，严紧型质粒。

非接合型质粒：相对分子量小，不能携带接合转移基因。

8)理想的质粒载体应具备哪些条件？①具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。

②具有多个单一限制性内切酶酶切位点。

③具有两种以上标记基因。

④具有安全性。

9)简述pBR322质粒载体的主要特征？P2510)构建λ噬菌体载体的主要内容有哪些？为什么野生型的噬菌体DNA不宜作为基因工程载体?该如何改造？p28插入型和取代型基因组大而复杂11)何为α-互补，在载体构建中有何作用？α-互补：指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，由1024个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。

α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间可实现的功能互补而建立的。

将缺失编码第11-41位氨基酸的β-半乳糖苷酶基因称为lacZ△M15基因而将半乳糖苷酶基因(lacZ) 的调控序列和编码β-半乳糖苷酶N端140个氨基酸的序列称为lacZ’.这两个基因的产物单独存在时都无酶学活性,但混合在一起时却有酶学活性.所以在载体上加lacZ’/(MSC),并在受体菌中引入lacZ △M15即可实现α-互补.IPTG是lac操纵子的诱导物,底物X-gal被β-半乳糖苷酶分解后可以产生蓝色.如果质粒载体中插入了外源DNA, lacZ’的产物则不能与lacZ△M15基因的产物实现α-互补，在 IPTG诱导下不能产生有活性的β-半乳糖苷酶，菌落便不可能呈现蓝色。

白色菌落便是含有插入了外源DNA的重组质粒。

因此可利用菌落颜色变化来筛选插入外源DNA的重组质粒。

这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。

主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β-半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的λ载体转入lacˉ的宿主菌后，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。

12)将外源性DNA克隆到-半乳糖苷酶失活的插入型入噬菌体上后，如何筛选重组噬菌体？13)简述单链DNA噬菌体M13在基因工程中的主要用途？14)什么是Cos质粒？简述其基本特点。

15)什么是酵母人工染色体、细菌人工染色体、哺乳动物人工染色体？从哺乳动物中分离出复制起始区、端粒及着丝粒构建载体可以克隆大于1000Kb的DNA 16)什么叫插入失活，举例说明之。

名称来源特点用途M13噬菌体载体M13mp1是构建的第一个M13噬菌体载体，随后构建的一系列M13载体都是在此基础上经改建派生出来的。

可用来克隆具有不同限制末端的外源DNA片段，而且克隆片段插入方向是固定的。

1.可以制备单链DNA进行DNA序列分析。

2.可以制备只与外源DNA的任意一条链互补的DNA探针。

3.可以在寡核苷酸介导的基因定点突变来制备含有目的基因的单链DNA模板。

Chapter ⅣThe technical principle of genetic manipulation1)简述提取基因组DNA的主要步骤和原理？2)分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？3)简述提取RNA常用的两种方法和相关原理？4)列举三种常用的核酸检测方法和基本原理？5)简述琼脂糖-EB电泳法分离纯化DNA的基本原理？6)名词解释：分子杂交、核酸杂交探针7)切口平移标记探针的主要步骤有哪些？8)简述Southern印迹杂交的基本原理及其主要步骤？9)简述Northern印迹杂交的基本原理及其应用？10)简述Western印迹的基本原理及其主要步骤？11)简述Sanger碱基顺序分析法的基本原理？12)简述酵母双杂交技术的基本原理和在基因工程中的应用？13)简述酵母单杂交技术的基本原理和操作过程？14)什么是噬菌体展示技术？简述其基本操作过程？15)什么是DNA迁移率变动试验？简述其基本原理？16)什么是DNase I足迹实验？简述其基本原理？Chapter Ⅴ Polymerase Chain Reaction Technology and Application1)什么是PCR技术？简述其基本原理？2)简述PCR 反应体系的主要成分与反应流程？3)简述PCR引物设计的目的和一般原则？4)简述提高PCR反应特异性的因素和措施？5)什么是巢式PCR、降落PCR、反转录PCR？它们分别有哪些应用？6)简述荧光定量PCR的基本原理？为什么在定量PCR中要引入Ct值的概念？Chapter Ⅵ RNAi and miRNA regulation1)什么是RNA干扰技术？2)简述利用RNA干扰技术沉默基因的基本原理和一般操作流程？3)什么是siRNA？如何选择siRNA靶位点？4)简述获得siRNA的途径有哪些？Chapter Ⅶ Obtaining of target gene1)目的基因克隆时常用哪些方法分离和获得基因？2)什么是基因文库？简述构建基因文库常用的载体有哪些？3)什么是基因组文库？简述构建基因组文库的一般步骤？4)什么是cDNA文库？简述构建cDNA文库的主要步骤？5)目的基因与载体的连接方法有哪些？各有哪些优点？基因重组时在两个酶切位点中其中有一个不相匹配时，你如何解决连接问题？6)如果目的基因的基因结构中有内含子存在，而且要采用原核表达系统，你应如何分离克隆基因？Chapter Ⅷ Recombination and gene transfer1)cDNA克隆较之基因组克隆的优越性体现在哪里?2)试述T-A克隆法的原理和用途？3)基因工程宿主菌必需具备哪些特性？4)名词解释：受体细胞、感受态细胞、转化、转染、转导5)简述将重组DNA导入原核细胞的方法有哪些？6)简述将重组DNA导入真核细胞导的方法有哪些？7)外源基因导入植物的方法？8)Ti 质粒的结构特点？Ti 质粒介导植物基因转移的过程？Chapter Ⅸ Screening and identification of recombinant clones1)如何从所克隆到的基因重组载体中鉴定目的基因的存在和正确性2)重组子的筛选与鉴定主要有哪些方法？3)重组子的遗传学检测法主要包括哪两类？4)简述根据载体表型特征进行重组子筛选的常用方法及其基本原理？5)如何利用抗性标记基因筛选阳性克隆？6)名词解释：插入失活效应7)LacZ 基因通常用于构建质粒载体的目的和原理？如何利用LacZ标记基因筛选阳性克隆？8)报告基因检测法筛选重组子对报告基因有哪些基本要求?举例说明重用的报告基因有哪几种？Chapter ⅩExpression of cloning gene1)大肠杆菌作为基因工程受体菌有哪些优缺点？2)实现真核基因在大肠杆菌表达系统的正确表达需要哪些基本条件？3)名词解释：启动子、终止子、SD序列、包涵体4)蛋白质包含体复性的方法有哪些？5)可使外源基因在大肠杆菌中高水平表达的启动子应具备哪些条件？6)常用大肠杆菌表达载体有哪些？简述λPL启动子表达载体和T7噬菌体RNA聚合酶/启动子表达载体的主要特征？7)原核表达系统常采用的启动子有哪些？Lac、Tac、trp启动子各自有何特点？8)在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体需具备哪些条件？9)利用大肠杆菌进行外源蛋白质主要有哪几种表达部位？采用相应表达形式有何优缺点？10)名词解释：融合基因、融合蛋白11)提高外源基因表达效率一般从那几个方面进行考虑？12)从提高转录启动效率及翻译起始效率角度考虑，可通过哪些措施构建高效率表达载体，提高外源基因表达效率？13)避免外源基因表达蛋白被宿主细胞内源蛋白水解酶降解的主要措施有哪些？14)简述大肠杆菌表达外源基因产物的检测方法有哪几种？15)与原核细菌相比，酿酒酵母做为外源基因表达受体菌有哪些优点？16)酵母表达系统有哪些优缺点？17)酵母基因表达系统主要有哪些基本结构？常采用的选择标记基因有哪些？18)简述酵母表达载体的种类和主要特征？19)甲醇酵母表达系统的主要特点？20)酵母DNA转化的方法有哪几种？21)酵母菌的蛋白修饰分泌系统有哪些功能？对外源基因的蛋白表达有何作用？根据课堂讨论题目扩增思考题目1)基因芯片技术的概念、原理和主要的应用？2)基因治疗的概念与策略？基因治疗的基本程序？3)转基因动物的概念，显微注射法制备转基因动物的主要过程4)何谓动物克隆技术？有何应用价值？5)转基因植物有哪些应用价值？。