差示分光光度法
• 普通分光光度法一般只适于测定微量组分， 当待测组分含量较高时，将产生较大的误差 。需采用示差法。 • 即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待 测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。 • 设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为 cs(cs < cx)。则： • Ax= εb cx As = εb cs • ΔＡ＝Ａx －Ａs =εb(cx － cs ）=εbΔc • 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与 标准溶液的吸光度之差ΔＡ。示差法测得的 吸光度与Δc呈直线关系。由标准曲线上查得 相应的Δc值，则待测溶液浓度cx ： • cx = cs + Δc
紫外-可见分光光谱的应用
1、在鉴别中的应用 （1）对比吸收光谱特征参数； （2）比较吸收度比值的一致性； （3）对比吸收光谱的一致性。 2、在杂质检查中的应用 3、在含量测定中的应用 （1）对照品比较法； （2）吸收系数法； （3）计算分光光度法。
1.对照品比较法
Cx—供试品溶液的浓度 CR—对照品溶液的浓度 Ax —供试品溶液的吸收度 AR —对照品溶液的吸收度 2.吸收系数法
双波长分光光度法
• 不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两 束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1 作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收 较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度 、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所 提高。 • ΔＡ＝A λ2 －A λ1 ＝（ελ2 －ελ1 ) b c • 两波长处测得的吸光度差值ΔＡ与待测组分浓度 成正比 • （例子：课本366页）
紫外分光光度计使用注意事项 • 1 仪器的校正和检定 • 1.1 波长 • 由于温度变化对机械部分的影响，仪器的 波长经常会略有变动，因此除应定期对所 用的仪器进行全面校正检定外，还应于测 定前校正测定波长。
紫外分光光度测定方法
• 普通测定分光光度法
• 1.单组分的测定 • 通常采用 A-C 标准曲线法定量测定。 • 2.多组分的同时测定 • ⑴若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自 最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组 分测定没有区别。 • ⑵若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸 光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量 。 • Aλ1= εaλ1bca ＋ εbλ1bcb • Aλ2= εaλ2bca ＋ εbλ2bcb
导数分光光度法
• 导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析 、消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光 谱的辨析等方面，显示了很大的优越性。 • 利用吸光度(或透光度)对波长的导数曲线来进行分 析： • Ｉ＝Ｉ0 e-εbc • 假定入射光强度Ｉ0 在整个波长范围内保持恒定： • dI 0 /dλ＝0 • 则：dI/dλ＝－Ｉ0 bc e -εbc dε/dλ • ＝－Ｉ0 bc dε/dλ • （例子：课本233页）
1 = lo g = Beer-Lambort 定律 A E c l T *A为吸收度；
*T为透光率； *E为吸收系数（以 E *c为溶液浓度； *l为样品总厚度。
1% 1cm
表示，溶液浓度为1%（g/ml），厚度为1cm时的吸光度值）
适用条件：入射光为单色光 溶液是稀溶液 固体、 液体和气体样品在同一波长 下，各组分吸光度具有加和性
紫外分光光度计基本原理仪器源自要部件主要应用基本原理
• 概述：紫外-可见分光光度法是通过被测物 质在紫外-可见光区的特定波长或一定波长 范围内光的吸收度，对该物质进行定性和 定量分析的方法。主要用于药品的鉴别、 检查和含量测定。 • 范围： 紫外光区（200~400nm）
可见光区（400~760nm）
例 苯磺舒：用含盐酸的乙醇[取盐酸溶液（9-1000）2ml，加乙醇制 成100ml]制成没1ml中含20ug的溶液，在225nm与249nm的波长 处有最大吸收，在249nm波长处的吸收度为0.67 。
甾体激素类药物：丙酸倍氯米松的乙醇溶液（20ug/ml），在 239nm的波长处应有最大吸收，吸光度为0.57~0.60;在239nm与 263nm波长处的吸光度比值应为2.25~2.45
①杂质的无关吸收再310~340nm的波长范围内几乎呈一条直 线，且随波长的增大吸光度下降。
②物质对光吸收呈加和性的原理，即在某一样品的吸收曲线 上，各波长的吸光度是维生素A与杂质吸光度的代数和，因而吸收 曲线也是二者吸收的叠加。
3、药物的鉴别
对比吸收光谱特征数据 对比吸收度（或吸收系数）的比值 对比吸收光谱的一致性
2、药物的含量测定
如巴比妥类药物的含量测定（巴比妥类药物在碱性介质中 电离为具有紫外吸收特征的结构）、芳酸及其脂类药物含量测定、 维生素A含量测定（在325~328nm的波长范围内有最大吸收）等。
三点校正法
本方法是在三个波长处测得吸光度，根据校正公式计算吸光 度校正值后，再计算含量。其原理主要基于以下两点：
仪器主要部件
光源 单色器 吸收池 检测器
信号显 示系统
光
源: 常采用氘灯和钨卤灯 钨灯最适宜的使用波长范围为320～1000nm。 氘灯能发出光的波长范围一般为190～400nm 单色器：棱镜或光栅 吸收池：玻璃或石英吸收池 检测器：光电池、光电管、光电倍增管及二极管阵列检测器
仪器分类
• • • • 单光束紫外可见分光光度计 准双光束紫外可见分光光度计 双光束紫外可见分光光度计 双波长紫外可见分光光度计
C=A/（E1%1cm· L）
Cx=（Ax/AR）CR
主要应用
1、药物的杂质检查
利用药物与杂质对光的选择性吸收性质的差异，若药物在杂质的 最大吸收波长处没有吸收，则可在此波长处测样品溶液的吸收度，通 过控制样品溶液吸收度来控制杂质的量。 例：地蒽酚中二羟基蒽醌的检查 二羟基蒽醌的三氯甲烷溶液 在432nm处有最大吸收，而 地蒽酚在该处几乎无吸收。
4.结构分析
• 1.判别物质的异构体，如互变异构体， 顺反异构体，开链和成环异构体，旋 光异构体，空间异构体等。反式异构 体空间位阻小，共轭程度较完全。最 大吸收峰波长，最大摩尔吸收系数， 大于顺式。 • 2.推测物质的共轭体系和部分骨架 • 一般需与色谱，红外，质谱，波谱等 多种仪器联合作物质的结构分析。