主要内容
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光谱分析法
分光光度计
实验步骤和要求
722型分光光度计
722型分光光度计操作步骤
1、开机，打开盖板，预温30min；
2、将转换旋钮转至“T”，用“0”旋钮以“空白”调透光度至零； 3、盖上盖板，光路自动打开，用“100”旋钮调透光度至100%， 若不能 调至100%，可调节灵敏度旋钮； 4、将转换旋钮转至“A”，此时吸光度A应为零，若非零，调节“消光零” 旋钮至零；
A
对末知浓度物质测定 时，无需再作标准管 ，据测定管吸光度从
0.8 0.6
●
标准曲线上即可求得
测定物的浓度。
0.4
●0Βιβλιοθήκη 2C标准曲线(浓度-吸光度曲线）
②对比法： 将标准品与待测样品在相同条件下显 色并测定各自的吸光度：
As = abCs； Ax = abCx 由于测定体系温度、厚度及入射光波 长一致，故标准与待测样品a&b值相等， 可用下式比较计算待测样品浓度： Cx=Cs Ax / As
Beer定律：当一适当波长的单色光通过溶液时，若液层厚 度一定，透射光的强度随着溶液浓度的增加而成指数函数 减少，即 It=Io*10-k2c 其吸光度与溶液浓度成正比。 式中c为物质的量浓度(或质量浓度)，k2为与吸光物质种 类、溶剂、入射光波长、液层厚度和溶液温度有关的常数。 Beer定律仅适用于单色光。
如果同时考虑溶液浓度C 和液层厚度b对光吸收的影响， 将Lambert和Beer定律合并，用a取代k1和k2 两个常数则可以 推出 It=Io*10-k1b It=Io*10-k2c
It=Io.10-abc
a为吸光系数，与入射光的波长和溶液的性质有关，为常数；
b为液层厚度；
c为溶液浓度。
入射光 I0
E=hu=hc/l
近红外光
中红外光 远红外光 微波 无线电波
0.76~2.5um
2.5~5.0um 5.0~1000um 0.1~100cm 1～1000m
物质的颜色与光的关系
完全吸收
完全透过
吸收黄色光
对溶液来说，溶液呈现不同的颜色，是由于
溶液中的质点(分子或离子)选择性的吸收某种颜
色的光所引起的。如果各种颜色的光透过程度
光源： 可见和紫外分光光度计装有两种光源灯泡： 钨丝灯，产生可见光； 氢弧（氘）灯，产生紫外线。
由于玻璃吸收紫外线，所以氢弧灯的灯管多用石英制成， 或在灯管上设有石英窗。
色散元件（棱镜或光栅）
单色器：
光狭缝 单色器的作用是将混合光分解（色散），并 可根据需要使一定波长的单色光投射至比色 槽。
1、比色杯应相匹配性（对光的吸收和反射应一致），不得随意挪用。
2、比色杯应持其侧壁的毛玻璃面。
3、盛液时达到比色杯的3/4即可，不能太满，外壁如有液体， 只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。 4、测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误后方可倒掉。 5、测量完毕，比色皿用蒸馏水洗干净。
思考题： 722型分光光度计为什么每变换一次波长都需要重新调零？ 由于比色仪光电管对不同波长和频率的光的敏感度是不 同的，所有每一次调换波长后都需要再次调零，是光电 管检测的灵敏度调制适当的范围。
[例11.1]已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合 物用乙醇作溶剂配成浓度为0.150mmol×L-1的溶液，在 480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8%，求该化 合物在上述条件下的质量吸光系数a。 解：由Lambert-Beer定律可得 已知c = 0.150*10-3mol×L-1，b = 2.00cm，T = 0.398
5、拉动横杆，读取吸光度。
实验一 可见分光光度计波长校正
原理：镨铷玻璃是一种含有稀有金属镨和铷的 玻璃制品，在可见光波长范围内，具有特征性 的吸收光谱，吸收峰的波长固定，可作为校对 仪器波长正确性的一个依据。
操作步骤：
用镨铷玻璃与空白光路作对照，每隔2nm， 在529nm附近每隔1nm，以波长为横坐标，吸光 度为纵坐标，测出波长从524nm～538nm的镨铷 玻璃吸收吸光度，查找吸收峰的极值。
实验二 血红蛋白及衍生物吸收光谱测定
原理：血红蛋白在不同条件下可以形成不同的衍生物， 如血红蛋白溶液在空气中与氧气充分接触可形成氧合血 红蛋白HbO2 ，与一氧化碳反应则会合成碳氧血红蛋白HbCO ，高铁 氰化钾能使血红蛋白中的二价铁氧化成三价铁，形成高 铁血红蛋白（MHb）。

HbO2 HbCO MHb
相同，这种物质就是无色透明的。如果只让一
部分波长的光透过，其他波长的光被吸收，则 溶液就呈现出透过光的颜色，也就是溶液呈现 的是与它吸收的光成互补色的颜色。例如硫酸 铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈蓝色；
2、光吸收的基本定律（Lamber-Beer定律）
单色光通过吸光溶液后，吸光度与溶液 的浓度和厚度之间呈正比关系。
比色杯： 形状大多为矩形。 比色杯的光径（溶液厚度）愈大，吸收的光能 愈多，灵敏度愈高。
光电元件：光电管或光电倍增管
作用：将光能转变成电能。
光电管产生光电流的大小，与光强度和波长有关。
光电管对弱光的灵敏度大，光照过强或长时间曝光灵敏 度显著下降，即“疲劳” 现象。 温度对光电管的灵敏度有影响。
混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在
一起。
将光（电磁波）按波长（或频率）顺序排列，即得电磁波 谱。 200nm 400nm 760nm 1mm 紫外线 可见光 红外线 不同波长的光具有不同能量，波长越长 （频率越低），能量越小。
可
见
光
三、吸收光谱与分光光度法
1、吸收光谱（Absorption 原子吸收光谱 spectrum）
吸收光谱（absorption spectrum）
所谓吸收光谱就是用各种不同波长光线测定物质溶液的吸光 度，然后按其结果描出吸光度与波长关系的曲线。 吸收光谱是物质的特征性曲线，一种物质在一定的PH、温度、 浓度等条件下，具有的一定形状的吸收光谱曲线
吸收光谱
吸收光谱曲线， 在浓度一定的条件下，以波长 为横坐标，以吸光度为纵坐标， 所绘制的曲线。 曲线上吸光度最大的地方称为 最大吸收峰，它所对应的波长 称为最大吸收波长，用1max 表示。最大吸收波长处测定吸 光度，则灵敏度最高 溶液浓度愈大，吸收光谱的峰 值愈高，两者成正比关系。
吸收光谱
可见、紫外分光光度法 原子吸收分光光度法 红外分光光度法 荧光分析法 火焰发射光谱法 比浊法
发射光谱
散射光谱
分光光度法

分光光度法（Absorption Photometry）是一种 基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方 法。包括可见吸光光度法、紫外-可见吸光光度法和 红外光谱法等。
2009年3月
一、概述
利用各种物质所具有的发射、吸收或散射的特性以确定物 质的结构和化学成分的分析方法称为光谱分析法。 英文为spectral analysis或spectrum analysis。各种结 构的物质都具有自己的特征光谱，光谱分析法就是利用特 征光谱研究物质结构或测定化学成分的方法。
吸收光谱曲线绘制
以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，描出所有测量的点 ，用曲线连接 在坐标轴上标出 波长、吸光度以及单位 标出最大吸收峰处的波长及吸光度 在上方注明曲线的名称 “血红蛋白及其衍生物吸收光谱曲线” 在曲线旁边标注曲线对于的物质 把姓名序号标注在空白处
2009年3月
注意事项
/
KMnO4吸收光谱曲线
吸收光谱体现了物质的特性，是进行定性、定 量分析的基础。lmax是定性分析的依据，而溶 液的浓度愈大，则吸光度A愈大，是进行定量分 析的依据。
主要内容
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光谱分析法
分光光度计
实验步骤和要求
分光光度计
0.20 8
光源
单色器
比色杯
检测器 (光电元件)
读数单元
紫外-可见分光光度计的基本结构示意图
入射光
C
透射光
I0 b
I1t
I a 被物质吸收的光
（1）Lambert定律： 说明吸收与溶液液层厚度间的关系
入射光
透射光
入射光
透射光
I0 L1
I1
I0 L2
I2
L2 ＞ L1
，I 1
＞ I2
Lambert定律：当一适当波长的单色光通过一固 定浓度的溶液时，其透射光强度随液层厚度的增 加而成指数函数减少，即It=Io*10-k1b
V= c / λ
光的微粒性
光量子，具有能量。
E=hv
h－普朗克(Planck)常数 6.626×10-34J·s －频率 E－光量子具有的能量
单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)
V=E/h
波粒二象性
V=c / λ c / λ= E / h
v=E/h
E=hc/ λ
结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越 长(频率越低)，光量子的能量越低。 单色光：具有相同能量(相同波长)的光。
分子吸收光谱
当光辐射通过某种物质时，组成该物质
的分子与光子发生“碰撞”，光子的能量就转
移至分子上，使它们由基态(低能态)跃迁到
激发态(高能态)。
吸光光度法基本原理
光谱名称 波长范围
当光子的能量与分子的E匹配时， 就会吸收光子
X射线
远紫外光 近紫外光 可见光
0.1~10nm
10~200nm 200~400nm 400~760nm
分光广度法的优点： 灵敏度高
测定简便快速，仪器设备简单。
不破坏样品
(1) 光的基本性质:电磁波的波粒二象性
波动性
光的传播速度:
c=λXν