南极磷虾胰蛋白酶的结构分析及适冷性机制研究周婷婷，王锡昌，李燕（上海海洋大学食品科学与工程学院，上海 201306）摘要：本文基于酶的纯化鉴定、动力学分析、序列比对和结构预测，对南极磷虾胰蛋白酶的结构及适冷性进行研究，通过与其他几种适冷、中温胰蛋白酶进行差异性分析，探讨南极磷虾胰蛋白酶等适冷酶在催化反应过程中应对低温环境的机制。

结果显示适冷胰蛋白酶和中温胰蛋白酶的催化中心严格保守，遵循一致的催化机制；但南极磷虾胰蛋白酶等适冷酶为了适应低温环境，各级结构都表现出一定的应对机制：疏水性残基含量偏高、带正负电荷残基含量偏低，分子内部疏水作用增强、盐桥减少，这些因素致使适冷胰蛋白酶蛋白质分子内的相互作用减弱，分子柔性增强。

适冷胰蛋白酶具有更高比例的呈松散状的无规卷曲结构，一定程度提高了其柔性；底物专一性口袋周围空间位阻更小，底物更容易接近活性中心，这也是加快催化反应的关键因素。

关键词：胰蛋白酶；适冷性；酶动力学参数；南极磷虾；结构预测文章篇号：1673-9078(2016)5-27-33 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.5.05Structure and Cold-adaptation Mechanism of Trypsin Purified from theKrill (Euphausia superba Dana, 1852)ZHOU Ting-ting, W ANG Xi-chang, LI Y an(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)Abstract: The molecular characterization of trypsin purified from Euphausia superba (Dana, 1852) was investigated in this research. Aspects such as thermodynamic activation parameters, sequence alignment, and molecular model allowed an in-depth understanding of its activity at low temperatures. Conserved residues were compared between cold-adapted trypsin and its warm-adapted counterparts, and the results showed that their active cores were almost identical. Strategies adopted by trypsin for molecular adaptation to low temperatures may be as follows. A higher proportion of hydrophobic residues and lower proportion of charged residues in the enzyme probably diminish the number of intramolecular interactions, resulting in improved structural flexibility. Increased number of loose random coils may also contribute to improve structural flexibility. Reduced steric hindrance is also a key factor that allows the substrate to easily access the active site, thus promoting the catalytic reaction.Key words: trypsin; cold-adapted; enzyme kinetic parameters; Euphausia superba ; molecular modeling南极磷虾生活于南极冰下，资源丰富，我国于20世纪80年代中期开始对南极磷虾进行调查和研究，于2009年开始进行大规模的商业捕捞。

南极磷虾生活的水域温度一般维持在-1.7 ℃至-3 ℃，属于嗜冷水性动物，体内的酶普遍具有适冷性，在催化反应过程可能遵循着一定的应对低温环境的机制。

其体内高效的蛋白质降解酶系统主要分布于南极磷虾的胃和肝脏中，在较低温度下仍具有活性，能够迅速降解各种蛋白质，27收稿日期：2015-05-03基金项目：国家高新技术研究发展（863）计划海洋技术领域主题项目（2011AA090801）作者简介：周婷婷（1985-），女，博士研究生在读，研究方向：食品科学与工程通讯作者：王锡昌（1964-），男，教授，博士研究生，研究方向：食品科学与工程对复杂蛋白质的降解活性比所有的商品酶均高[1]；南极磷虾死亡后，即使在低温环境保存，虾体也易于自溶、变质、腐败，这些现象可能都与南极磷虾体内蛋白酶的适冷性有着密切的关系。

胰蛋白酶是甲壳动物体内主要的蛋白酶之一，能够专一性地切断多肽链中赖氨酸和精氨酸残基羧基端的肽键，Osnes 等[2]的研究表明，南极磷虾蛋白酶具有的高效催化性，大约40%来源于胰蛋白酶的作用。

适冷酶通过特殊的应对机制能够在低温环境下保持一定的活性，相对中温酶表现出了更加优越的催化性能，已被广泛地应用于食品加工和化工领域。

有研究表明适冷酶的某些氨基酸含有比例与其适冷性有着密切的关系；适冷酶关键氨基酸残基的取代可能会改变其局部区域分子间的作用力，使分子结构的紧密程度发生变化，从而影响到其在低温环境中的催化能力[3]。

在本研究中，基于酶的动力学分析、序列比对和二级、三级结构预测，对南极磷虾胰蛋白酶的结构及适冷性进行研究，通过与其他几种适冷、中温胰蛋白酶进行差异性分析，探讨南极磷虾胰蛋白酶等适冷酶在催化反应过程中应对低温环境的机制，以期为其分子修饰及在食品和生物工程等领域的应用奠定基础。

1 材料和方法1.1 原料南极磷虾（2014年2月捕获于南极渔场48.1区），实验室-80 ℃低温保藏。

1.2 主要材料及仪器设备Superdex-75（GE）；Sepharose 4B（GE）；BApNA （SIGMA-Aldrich）；DEAE-Sepharose F. F. 预装柱（GE）；蛋白浓缩管（Millpore）；DW-86L626立式超低温冰箱（海尔集团有限公司）；SS250-E组织捣碎机（方胜电器实业有限公司）；冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂GL-20G-II）；电泳槽、电泳仪（北京市六一仪器厂）；凝胶成像仪（Bio-Rad 公司）；MALDI-TOF/TOF质谱分析仪（Bruker Corporation）。

1.3 试验方法1.3.1 酶活及蛋白质含量的测定酶活的测定以BApNA为底物。

将50μL的酶溶液（浓度为0.1 mM）与50 μL 的10 mM BApNA溶液（50 mM Tris-HCl，pH 8.07）混合，37 ℃反应3分钟, 410 nm处测定吸光度值，每分钟记录1次，即测定产物对硝基苯胺在1分钟内的吸光度值变化量。

酶活力单位U(BApNA Unit) =Δ A410nm/( 10-6 × 8800) 其中∆A410nm表示样品1分钟吸光度值的变化量。

8800 M-1 cm-1表示产物对硝基苯胺的摩尔消光系数。

10-6表示单位mol 与μmol之间的转换值。

蛋白质含量测定方法参考福林酚法。

1.3.2 纯化和鉴定由30~70%硫酸铵分级沉淀获取的南极磷虾胰蛋白酶粗酶，经DEAE-sepharose Fast Flow离子交换层析（1 M NaCl 0~100%梯度洗脱，pH 8.07，1.0 mL/min）、Superdex-75 凝胶层析（50 mM Tris-HCl，pH 8.07，0.8 mL/min）和Benzamidine Sepharose4B 亲和层析（50 mM HCl, 0.5 mL/min）进行分离纯化，纯化样品收集保存于-80 ℃待用，取少量上SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度检测及分子量测定[4]。

纯化的南极磷虾胰蛋白酶在SDS-PAGE凝胶电泳胶条上显示为一条带，切取并用50% 乙腈和100mM 碳酸氢铵漂洗直至蓝色褪尽。

加入50 μL DTT对样品进行还原，加入100 μL乙腈脱水5~10 min；加入50 μL 碘乙酰胺进行烷基化，以便使酶切位点完全暴露。

利用测序级牛胰蛋白酶对处理后的样品进行消化，加入1% 三氟乙酸（TFA）提取肽片段。

取2 μL样品溶液加入2 μL 10 mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液混匀，取上述混合液1μL点靶。

在室温条件下待样品干燥，500~1800 m/z的条件下进行质谱检测，方法参照Arvizu-Flores [3]。

1.3.3 动力学分析在37 ℃，pH 8.07反应条件下，选取浓度范围为0.05~1.00 mM的BApNA溶液为底物，每增加0.05 mM 底物浓度平行测定3次对应浓度的酶促反应速率，方法参照1.2.1。

基于Lineweaver-Buck 双倒数法作图得出样品K m和V max值，并以此计算K cat，K cat/K m。

1.3.4 序列比对及结构预测从NCBI数据中检索南极磷虾、温热带甲壳动物、寒带鱼类、温热带鱼类胰蛋白酶的由基因序列推测得出的蛋白质一级序列信息，通过ClustalX 2.0.12、DNAMAN进行序列比对分析；基于NCBI-Conserved Domains（/Structure/cdd/ wrpsb.cgi）对各序列的保守结构域进行分析，即对酶切位点、催化中心的活性位点及底物结合位点进行分析、对比。

基于ProtParam （/ protparam/）对各序列的氨基酸组成及相应蛋白质的理化参数进行检索、预测；通过PSIPRED（http://bioinf.cs. / psipred/）对蛋白质的二级结构进行预测并作差异性分析。

选取高分值模版，基于Swiss-Model （/）对胰蛋白酶进行建模，通过Swiss-PdbViewer软件展示其三维立体结构，并对适冷和中温胰蛋白酶的三维结构进行差异性分析。

1.3.5 数据处理酶活、蛋白质含量和动力学分析中酶促反应速率的测定每次做三个平行，结果取其平均值，并进行标准偏差分析。