水稻黄绿叶突变体w ３９０的遗传分析和基因定位董青１,２㊀张迎信１,２㊀张振华１,２㊀周全１,２㊀秦亚芝１,２,３㊀王宏１,２㊀程式华１,２曹立勇１,２,∗㊀沈希宏１,２,∗(１中国水稻研究所/国家水稻改良中心,杭州３１１４０１;２浙江省超级稻研究重点实验室,杭州３１１４０１;３四川农业大学水稻研究所/西南作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室,成都６１１１３０;∗通讯联系人,E Ｇm a i l :x i h o n g s h e n ＠１２６．c o m ;c a o l y c g f ＠m a i l ．h z ．z j．c n)G e n e t i cA n a l y s i sa n d G e n e M a p p i n g o fa Y e l l o w Ｇgr e e nL e a f M u t a n t w ３９０i n R i c e (O r yz a s a t i v a L ．)D O N G Q i n g １,２,Z H A N G Y i n g Ｇx i n １,２,Z H A N G Z h e n Ｇh u a １,２,Z HO U Q u a n １,２,Q I N Y a Ｇz h i １,２,３,W A N G H o n g１,２,C H E N G S h i Ｇh u a １,２,C A O L i Ｇy o n g １,２,∗,S H E N X i Ｇh o n g１,２,∗(１C h i n aN a t i o n a lR i c eR e s e a r c hI n s t i t u t e /N a t i o n a lC e n t e r f o rR i c e I m p r o v e m e n t ,H a n g z h o u３１１４０１,C h i n a ;２K e y L a b o r a t o r y fo r Z h e j i a n g S u p e rR i c eR e s e a r c h ,H a n g z h o u３１１４０１,C h i n a ;３R i c eR e s e a r c hI n s t i t u t e /K e y L a b o r a t o r y o f S o u t h w e s tC r o p Ge n e t i c R e s o u r c e s a n dI m p r o v e m e n t ,M i n i s t r y of E d u c a t i o n ,S i c h u a nAg r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,Ch e n g d u６１１１３０,C hi n a ;∗C o r r e s p o n d i n ga u t h o r ,E Ｇm a i l :x i h o n g s h e n ＠１２６．c o m ;c a o l y c g f ＠m a i l ．h z ．z j ．cn )D O N G Q i n g ,Z HA N G Y i n g x i n ,Z HA N G Z h e n h u a ,e ta l ．G e n e t i ca n a l y s i sa n d g e n e m a p p i n g o fa y e l l o w Ｇgr e e nl e a f m u t a n t w ３９０i n r i c e (O r yz a s a t i v a L ．)．C h i n JR i c eS c i ,２０１５,２９(３):２４１Ｇ２４９．A b s t r a c t :A y e l l o w Ｇg r e e nl e a fm u t a n t ,d e s i g n a t e da s w ３９０,w a s i s o l a t e df r o mt h e p r o g e n y of ６０C o ＧγＧt r e a t e di n d i c a c u l t i v a rR ８０１５．T h em u t a n t e x h i b i t e da s t a b l e y e l l o w Ｇg r e e n l e a f p h e n o t y p e d u r i n g t h ew h o l e l i f e c y c l e ．T h e c h l o r o p h y l l b w a sn o td e t e c t e di n w ３９０,a n dt h ec h l o r o p h y l laa n dc a r o t e n o i d sc o n t e n t so f w ３９０w e r er e d u c e db y ５０．６％a n d ４４ ８％,c o m p a r e dw i t h t h ew i l d Ｇt y p e ．T h e p l a n t h e i g h t ,t h en u m b e r o f p a n i c l e p e r p l a n t ,t h en u m b e r o f s pi k e l e t s p e r p a n i c l e ,t h en u m b e r o f g r a i n s p e r p a n i c l eo f w ３９０w e r e r e d u c e db y １２．０％,２２．３％,１８．５％a n d２７．６％,r e s p e c t i v e l y．T h e t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p ea s s a y d e m o n s t r a t e dt h a t t h en u m b e ro f t h yl a k o i d sd e c r e a s e da n d g r a n a sw e r e p o o r l y s t a c k e d i n t h em u t a n t ,r e s u l t i n g i nu n d e r d e v e l o p m e n t o f c h l o r o p l a s t s ．G e n e t i c a n a l ys i s s h o w e d t h a t t h e y e l l o w Ｇg r e e n l e a f p h e n o t y p ew a s c o n t r o l l e db y a s i n g l e r e c e s s i v e g e n e ．U s i n g a nF ２m a p p i n gp o pu l a t i o nd e r i v e d f r o mt h e c r o s s o f w ３９０m u t a n t a n dN i p p o n b a r e ,t h e g e n ew a s d e l i m i t a t e d t o a r e g i o no f ７１．８Ｇk bo n t h e l o n g ar mo f c h r o m o s o m e １０,w h i c h c o n t a i n e d １５O R F s ．S e q u e n c e a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t h em u t a n t c a r r i e d t w o n u c l e o t i d e s u b s t i t u t i o n s i n t h e e i gh t h e x o no f O s C A O １g e n e ,w h i c h l e d t o t h e s u b s t i t u t i o n o f l e u c i n e a n d g l y c i n e f o r h i s t i d i n e a n d g l u t a m i c a c i d ,r e s p e c t i v e l y．T h i s i m p l i e d t h a t W ３９０m i gh t b e an o v e l a l l e l e o f O s C A O １g e n e ．K e y w o r d s :O r y z a s a t i v a L ．;m u t a n t ;y e l l o w Ｇg r e e n l e a f ;g e n em a p p i n g 董青,张迎信,张振华,等．水稻黄绿叶突变体w ３９０的遗传分析和基因定位．中国水稻科学,２０１５,２９(３):２４１Ｇ２４９．摘㊀要:通过６０C o Ｇγ辐射诱变籼稻中恢８０１５获得了一个在全生育期叶片均呈黄绿色的突变体w ３９０.与野生型相比,突变体中检测不到叶绿素b 的存在,且叶绿素a 和类胡萝卜素的含量分别降低了５０．６％和４４．８％;主要农艺性状调查结果显示,突变体的株高㊁单株有效穗数㊁每穗总粒数㊁每穗实粒数较野生型分别降低了１２．０％㊁２２．３％㊁１８．５％和２７．６％;透射电镜结果显示:突变体的类囊体数量明显减少,基粒垛叠方向异常;遗传分析表明该突变性状受一对隐性核基因控制.利用突变体与粳稻日本晴杂交构建的F ２群体,将突变基因定位至水稻第１０染色体长臂约７１．８k b 的区域内.对该区间包含的１５个O R F s 进行序列分析,发现突变体中编码叶绿素酸酯氧化酶１(c h l o r o p h y l l i d e ao x y ge n a s e １)的基因O s C A O １的第８外显子发生了两个单碱基突变,导致第３９４和３９６位的亮氨酸和甘氨酸分别突变为组氨酸和谷氨酸,推测该突变基因是一个O s C A O １功能丧失的新等位基因.关键词:水稻;突变体;黄绿叶;基因定位中图分类号:Q ３４３ ５;Q ７５４;Q ９４４ ５６㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀文章编号:１００１Ｇ７２１６(２０１５)０３Ｇ０２４１Ｇ０９收稿日期:２０１４Ｇ１１Ｇ２７;修改稿收到日期:２０１４Ｇ１２Ｇ２４.基金项目:国家科技支撑计划资助项目(２０１１B A D ３５B ０２);农业部水稻生物学与遗传育种学科群项目;浙江省公益技术应用研究项目(２０１３C ３２００３);中国农业科学院科技创新工程资助项目(C A A S ＧA S T I P Ｇ２０１３ＧC N R R I).１４２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i ),２０１５,２９(３):２４１－２４９h t t p ://w w w．r i c e s c i ．c n D O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００１Ｇ７２１６．２０１５．０３．００３㊀㊀叶色突变体是一类常见的突变体类型.它往往是由于突变基因直接或间接影响叶绿体的发育或光合色素的合成与降解过程,从而改变叶绿素的含量,最终导致叶色发生变异.叶色突变体在研究光合作用遗传机理㊁光合色素的合成和降解过程[１Ｇ４]㊁叶绿体分化与发育机制[５Ｇ６]等方面发挥着重要作用.而在实际应用中,叶色突变体由于其较高的辨识度,可作为表型标记用于杂交种生产中[７].多年以来,人们对叶色突变体进行了广泛的研究.水稻叶色突变体可分为黄化突变体㊁转绿突变体㊁温敏变色突变体㊁斑点和条纹(斑马叶)突变体㊁白化突变体㊁亮绿突变体㊁常绿突变体和紫叶突变体[８].叶色突变大多受１对隐性核基因控制,受显性核基因或细胞质基因控制的叶色突变极少被报道[９].迄今为止,已有近５０个水稻叶色相关基因被克隆.其中,基因N T R C㊁O s HA P３A/B/C㊁V Y L㊁O s C H R４㊁V１㊁V２㊁O s G l u R S㊁O s C l p P５㊁O s P P R１参与叶绿体的分化发育[１０Ｇ１６].基因R b c L㊁R b c S㊁L T C㊁O s C H L D/H/I㊁O s D V R㊁O s P O R A/B㊁O sＧC A O１/２㊁Y G L１㊁N Y C１㊁N Y C３㊁N Y C４㊁S G R㊁N O L 参与叶绿素合成与降解过程[２Ｇ４,１７Ｇ２５].另外,有些基因参与类胡萝卜素合成,如O s P D S㊁O s Z D S㊁O sＧC R T I S O㊁βＧO s L C Y编码的酶对类胡萝卜素前体A B A的合成十分重要[２６].而基因O s C a b１R㊁O sＧC a b２R㊁L h c b１㊁L h c b４㊁p s a A㊁p s b A㊁P L㊁O s D O S㊁O s R o p G E F１０㊁S T１㊁O s C B L１㊁e t l１/２㊁V３则参与可引起水稻叶色变化的其他生理过程[８].本实验室通过６０C oＧγ辐射诱变籼稻品种中恢８０１５(R８０１５)的种子得到一个稳定遗传的黄绿叶突变体w３９０.本研究对该突变体的生理特征㊁叶绿体超微结构以及主要农艺性状进行了考查,并对w３９０突变基因进行遗传分析㊁基因定位及候选基因分析,为进一步分析该基因,明确水稻叶色变异机制奠定了基础.１㊀材料与方法１．１㊀供试材料本研究所用的野生型水稻品种为国审籼型杂交稻内５优８０１５的恢复系中恢８０１５.利用６０C oＧγ辐射诱变中恢８０１５种子获得一个黄绿叶突变体,经多代自交稳定,命名为w３９０.将w３９０与叶色正常的粳稻品种日本晴进行杂交,构建用于遗传分析与定位的F２分离群体.于２０１３年夏季在中国水稻研究所富阳试验基地种植野生型㊁突变体和F２分离群体,所有材料每行１２株,株行距２０c mˑ２３c m,正常田间管理.１．２㊀表型与农艺性状考察于抽穗期,取中恢８０１５和w３９０的剑叶进行光合色素含量测定和叶绿体超微结构的观察,方法参照L i等[２７].于完熟期,随机挑选野生型和突变体各１０株,测量株高,收获后考查千粒重㊁单株有效穗数㊁每穗总粒数㊁每穗实粒数和单株产量.采用S A S软件的一般线性模型对野生型和突变体植株的光合色素含量及主要农艺性状进行方差分析[２８].１．３㊀群体构建２０１２年夏季在浙江富阳以突变体w３９０为父本与日本晴杂交,冬季于海南陵水种植F１,观察F１表型,并自交获得F２分离群体,２０１３年夏季将F２分离群体种植在富阳.随机选择F２分离群体的一个区域,考查黄绿叶性状的分离比,并用χ２进行检验.利用F２分离群体中获得的黄绿叶单株进行基因定位.１．４㊀D N A提取及标记检测采用改良的C T A B法[２９]提取中恢８０１５㊁日本晴㊁w３９０以及由w３９０和日本晴构建的F２分离群体中１０个正常叶色个体和６９７个黄绿叶个体的总D N A.标记检测过程如L i等[２７]所述.１．５㊀基因定位与克隆用于多态性筛选的D N A标记包括４３６个S S R 标记[３０]和９１个I n D e l标记[２７].根据F２分离群体植株表型,随机等量选取１０株黄绿叶突变体植株的D N A和１０株正常植株的D N A分别构建突变体D N A池和正常D N A池.利用在亲本间具有多态性的D N A标记对突变体D N A池和正常D N A池进行扩增,寻找在突变体D N A池中发生偏态扩增的分子标记.再利用突变单株验证有偏态扩增的分子标记,确定突变位点与分子标记之间的连锁关系.根据G r a m e n e(h t t p://w w w．g r a m e n e．o r g/)公布的日本晴和９３１１基因组序列,利用O l i g o７．０[３１]在初步定位的区间内设计I n D e l标记,进一步对目标基因进行精细定位.利用水稻基因组注释数据库(h t t p://r i c e．p l a n t b i o l o g y．m s u．e d u)进行候选基因分析.根据候选基因全长基因组序列,设计测序引物,采用高保真D N A聚合酶K O DＧP l u sＧV e r．２分别２４２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第２９卷第３期(２０１５年５月)扩增野生型和突变体候选基因的基因组序列,产物送上海英潍捷基贸易有限公司测序,测序结果用M e g A l i g n 软件进行序列比对,确定突变位点.１．６㊀三维结构预测采用同源建模法对野生型和突变体黄绿叶基因的蛋白三级结构进行预测.在S W I S S ＧMO D E L (h t t p ://s w i s s m o d e l ．e x p a s y ．o r g )服务器中,使用同一模板对野生型和突变体目的基因编码的蛋白分别建模,用拉氏构象图(R a m a c h a n d r a n )对构建好的模型进行质量评估.采用S P D B V 软件对野生型和突变体的蛋白模型进行叠合.１．７㊀叶色相关基因的表达分析R N A 的提取及c D N A 的反转录合成过程如L i等[２７]所述.利用T HU N D E B R B I R D S Y B R q P C RM i x (T O Y O B O ,日本)进行实时荧光定量P C R .内参基因为A c t i n (登录号为L O C _O s ０３g ０８０２０).光合色素合成与降解㊁叶绿体发育及光合作用相关基因的表达引物参考刘胜等[３２].２㊀结果与分析２．１㊀突变体的生理特征和主要农艺性状突变体w ３９０所有叶片在全生育期均呈黄绿色(图１).在抽穗期测定叶绿素含量,发现突变体的光合色素含量较野生型中恢８０１５降低了５８．０％(表１).其中,以叶绿素b 的降低最为明显,在突变体中检测不到叶绿素b 的存在;而叶绿素a 和类胡萝卜图１㊀野生型和突变体的表型F i g ．１．P l a n t p h e n o t y p e o f t h em u t a n t a n d i t sw i l d Ｇt y pe p a r e n t ．素的含量也分别降低了５０．６％和４４．８％.农艺性状方面,突变体w ３９０的株高较野生型降低了１２．０％,每穗总粒数㊁每穗实粒数和每株有效穗数分别减少了１８．５％㊁２７．６％和２２．３％(表２),而千粒重的差异不显著.这些结果表明,叶色发生变化对突变体的主要农艺性状产生了显著影响,但并未影响籽粒的灌浆和充实效率.这可能是由于叶色变化降低了突变体的光合效率,从而影响了植株的正常生长和发育.２．２㊀叶绿体结构的电镜观察将突变体和野生型的叶片分别放于透射电镜下观察,发现突变体w ３９０的叶绿体数目大小与野生表１㊀突变体和野生型叶片的光合色素含量比较T a b l e １．C o m p a r i s o no f p h o t o s y n t h e t i c p i g m e n t c o n t e n t s i n l e a v e s b e t w e e n t h em u t a n t a n d i t sw i l d Ｇt y pe p a r e n t ．m g /g光合色素含量P h o t o s y n t h e t i c p i gm e n t c o n t e n t 中恢８０１５R ８０１５w ３９０P叶绿素aC h l o r o p h y l l a ２．６５ʃ０．０３１．３４ʃ０．０５＜０．０００１叶绿素bC h l o r o p h y l l b ０．７４ʃ０．０５０．００＜０．０００１类胡萝卜素C a r o t e n o i d s０．６６ʃ０．０４０．３６ʃ０．０１＜０．０００３总含量T o t a l c o n t e n t ４．０５ʃ０．０７１．７０ʃ０．０６＜０．０００１表２㊀突变体和野生型的主要农艺性状比较T a b l e ２．C o m p a r i s o no fm a i na g r o n o m i c t r a i t s b e t w e e n t h em u t a n t a n d i t sw i l d Ｇt y pe p a r e n t ．性状T r a i t中恢８０１５R ８０１５w ３９０P株高P l a n t h e i gh t /c m １１２．３ʃ５．２９８．９ʃ５．５０．０００３单株有效穗数N o ．o f p a n i c l e s p e r p l a n t ８．１ʃ１．４６．３ʃ１．８０．０２２７每穗总粒数N o ．o f s p i k e l e t s p e r p a n i c l e １１８．０ʃ９．１９６．２ʃ７．３＜０．０００１每穗实粒数N o ．o f g r a i n s p e r p a n i c l e７１．１ʃ６．７５１．５ʃ５．９＜０．０００１千粒重１０００Ｇg r a i nw e i g h t /g ３３．５ʃ０．４３１．９ʃ０．５０．３０６７单株产量G r a i n y i e l d p e r p l a n t /g１９．３ʃ２．８１０．３ʃ１．４＜０．０００１３４２董青等:水稻黄绿叶突变体w ３９０的遗传分析和基因定位A 和B －野生型的叶肉细胞和叶绿体结构;C 和D－突变体的叶肉细胞和叶绿体结构;N－细胞核;C P －叶绿体;G Ｇ基粒.Aa n dB ,M e s o p h y l l c e l l a n dc h l o r o p l a s t o fw i l d Ｇt y p e ,r e s p e c t i v e l y ;Ca n dD ,M e s o p h y l l c e l l a n d c h l o r o p l a s t o fm u t a n t ,r e s p e c t i v e l y．N ,N u c l e u s ;C P ,C h l o r o pl a s t ;G ,G r a n a ．图２㊀野生型和突变体的叶绿体超显微结构比较F i g ．２．C o m p a r i s o no fu l t r a s t r u c t u r e s o f c h l o r o p l a s t s i n t h em e s o p h yl l c e l l s b e t w e e n t h em u t a n t a n d i t sw i l d Ｇt y pe p a r e n t ．型相差无几(图２ＧA ㊁C ).但野生型叶绿体基质浓厚,类囊体丰富,基粒垛叠整齐且排列紧密;而w ３９０类囊体数量明显减少,基粒排列疏松,且基粒垛叠方向差异较大(图２ＧB ㊁D ).该结果表明w ３９０中基因突变影响了水稻类囊体与基粒的正常发育.２．３㊀突变体基因的图位克隆以突变体w ３９０为父本,正常叶色的日本晴为母本进行杂交,对F １植株和自交得到的F ２群体的叶色进行考查.F １植株呈正常绿色,而F ２群体中出现明显的分离,包含正常叶色与黄绿叶两种表型.随机调查了２８２个F ２单株,发现正常叶色植株２１７个,黄绿叶植株６５个.卡方测验表明正常叶色与黄绿叶个体的分离比符合３ʒ１(χ２＝０．５７＜χ２０．０５＝３．８４,P ＝０．４４９４),说明该黄绿色突变性状是由１对隐性的核基因控制.利用均匀分布于水稻基因组的４３６个S S R 标记和９１个I n D e l 标记对突变体w ３９０和日本晴进行分析,共筛选到１０２个多态性标记.利用这些多态性标记对黄绿叶突变池和正常叶色池进行检测,发现位于第１０染色体上的R M ２２８和R M ６６７３在两个D N A 池间存在偏态扩增.利用这两个标记以及附近的R M ２５６６４㊁R M １４７㊁I n D １４１㊁R D １００６和R D １００７,对３０个黄绿色单株进行检测,确定突变基因位于第１０染色体,并将其界定在R M ２２８与R M ６６７３之间(图３ＧA ).为进一步精细定位突变基因,在R M ２２８和R M ６６７３之间新发展了４个在亲本间具有多态性的I n D e l 标记(表３).利用这６个标记,对F ２分离群体中剩余的６６７个黄绿叶单株进行分析.最终将黄绿叶基因界定在D ３和D ４间约７１．８k b 的基因组区域内(图３ＧB ).２．４㊀基因预测根据水稻基因组注释数据库(R i c e G e n o m e A n n o t a t i o nP r o j e c t )的序列预测信息,这７１．８k b 基因组区间内共包含１５个开放阅读框.其中,L O C _O s １０g ４１７６０(O s C A O １)编码叶绿素酸酯氧化酶１(c h l o r o p h y l l i d eao x y ge n a s e１,C A O １),是催化叶绿素a 向叶绿素b 转化的关键酶,该酶的缺失或失活将严重影响叶绿素b 的合成[２０Ｇ２１].这与w ３９０中检测不到叶绿素b 存在的实验结果一致,所以初步将O s C A O １作为w ３９０的突变候选基因(图３ＧC ).表３㊀精细定位和测序所用的分子标记T a b l e ３．M a r k e r s u s e d f o r f i n em a p p i n g a n d s e q u e n c i n g．引物名称P r i m e r n a m e上游引物F o r w a r d p r i m e r (５ᶄ－３ᶄ)下游引物R e v e r s e p r i m e r (５ᶄ－３ᶄ)退火温度A n e a l i n g t e m pe r a t u r e /ħD ２C A G C C T C T C T A A T T G A C T C T CC C A A G T A G A A T G G C C A A A T G T ５５D ３G C A T C A A A C T A T A A T A A C T G A C T A G G A A A G T A A A C A A G G C C T T A５５D ４A C A C A T A T G T A G A G T A T T A T C C G G C A A G C T G T C T A C A C G G T T ５５D ８A A C T C T A T T G T T T A T G G T G GT A A T T C C G A A T T T C A G C T C T ５５C A O １Ｇ１C A T G C C T A C T T G T G T C A C TA C C G C T C A T G T G T A C C A T C５５C A O １Ｇ２G G C G T A T T C C A A A C C T A T T C G T T A G A A T A A A A T A C G G T G T G C T ５５C A O １Ｇ３A T T T C C T A C T A C C C G A A G C T GG A C T A T A G T A T G C G G T T A C C T T ５５C A O １Ｇ４G A T T A C A A T T G C A T C C C G T G A A T G C C A T C C A C A A A G A T G C T C５５C A O １Ｇ５C A G A A G A A G T C C A T G C T C C AC C G G T T C G A T A T C C A G T A T T G C ５５C A O １Ｇ６A G A T G A T A C T C T A G T T T C C G A C A A A T T A G A C A A A A C C A C C C T C G ６０４４２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i )㊀第２９卷第３期(２０１５年５月)A－将突变体基因定位至第１０染色体R M２２８和RM６６７３;B－突变体基因被界定在I n D e l标记D３和D４之间约７１．８k b的基因组区域内; C－序列分析发现突变体在L O C_O s１０g４１７６０的第８外显子存在两个单碱基突变,导致第３９４和３９６位的亮氨酸和甘氨酸分别突变为组氨酸和谷氨酸.A,T h em u t a n t l o c u sw a sm a p p e d o n t h e c h r o m o s o m e１０b e t w e e nR M２２８a n dR M６６７３．B,T h e l o c u sw a s n a r r o w e d t o a７１．８k b g e n o m i c r e g i o n b e t w e e n I n D e lm a r k e rD３a n dD４．C,S e q u e n c e a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t h em u t a n t c a r r i e d t w o n u c l e o t i d e s u b s t i t u t i o n s i n t h e e i g h t h e x o n o f L O C _O s１０g４１７６０,w h i c h l e d t o t h e s u b s t i t u t i o no f l e u c i n e a n d g l y c i n e f o r h i s t i d i n e a n d g l u t a m i c a c i d,r e s p e c t i v e l y．图３㊀突变体基因的定位与图位克隆F i g．３．F i n em a p p i n g a n d p o s i t i o n a l c l o n i n g o f t h em u t a n t g e n e．㊀㊀利用６对覆盖O s C A O１的特异引物(表３)扩增其基因组序列,比对测序结果发现,野生型的第１１８１位碱基T和第１１８４位碱基G在突变体中均被A替代(第８外显子),相应地,其编码的亮氨酸和甘氨酸分别被组氨酸和谷氨酸替代.于是,推测w３９０是一个O s C A O１功能丧失的新等位基因.２．５㊀野生型和突变体C A O１蛋白的三维结构预测将野生型和突变体C A O１蛋白的氨基酸序列分别提交到S W I S S MO D E L服务器,使用同一模板(３g b４．１C)进行三维结构的构建,结果如图４所示.利用S P D B V软件的拉氏构象图(R a m a c h a n d r a n p l o t)对构建好的三维模型进行立体化学检查(图５),在野生型和突变体C A O１的预测模型中,分别有９６．７％和９６．０％的氨基酸残基的二面角落在允许区(图中蓝线包围区),有９０．７％和９０．２％的氨基酸残基的二面角落在最适宜区域(图中黄线包围区),这说明野生型和突变体C A O１预测模型符合立体化学φ㊁ψ二面角分布的要求,表明模拟得到的C A O１的三维结构在理论上是可靠的.将野生型和突变体C A O１的三维结构进行叠合(图４ＧC),发现在突变体中,不但与突变位点在一级结构上相邻的３８２－３９６位氨基酸所在区域的结构发生改变(野生型与突变体分别以红色和深蓝色表示),而且与其在三维空间上相邻的４２３－４３２位氨基酸所在区域的结构也发生了改变.２．６㊀叶色相关基因的表达分析通过实时荧光定量P C R检测野生型和突变体中叶色相关基因的表达.检测目标中与叶绿体发育相关的基因:包括编码定位在叶绿体上的蛋白质N U S１的V１,编码三角状五肽重复蛋白的O s PＧP R１;与色素结合蛋白编码有关的基因包括编码捕光叶绿素a/b结合蛋白的基因O s C a b１R㊁O sＧC a b２R㊁L h c b１㊁L h c b４,编码光系统Ⅰ叶绿素脱辅基蛋白的基因p s a A,编码光系统Ⅱ醌结合蛋白的基因p s b A;与光合色素合成与降解有关的基因,包括编码联乙烯还原酶的基因O s D V R,编码核酮糖Ｇ１,５４２董青等:水稻黄绿叶突变体w３９０的遗传分析和基因定位A－野生型;B －突变体;C －野生型与突变体的叠合.红色与深蓝色分别代表突变体位点在野生型与突变体中所在位置,紫色和浅蓝色分别代表野生型和突变体的P a O 结构域.A ,W i l d Ｇt y p e ;B ,M u t a n t ;C ,S u p e r p o s i t i o no f t h em u t a n t a n d i t sw i l d Ｇt y p e ．T h e r e da n dd a r kb l u e l i n e s r e p r e s e n t t h e s t r u c t u r e h a b o r i n g t h e m u t a t i o n s i n t h em u t a n t a n d i t sw i l d Ｇt y p e ,r e s p e c t i v e l y ．T h e p u r p l e a n d l i g h t b l u e r e g i o n s r e p r e s e n t t h e p h e o p h o r b i d e a o x y g e n a s e (P a O )d o m a i n i n t h em u t a n t a n d i t sw i l d Ｇt y p e ,r e s p e c t i v e l y．图４㊀野生型和突变体C A O １蛋白三维预测结构的比较F i g ．４．C o m p a r i s o n o f ３D p r o t e i n s t r u c t u r em o d e l o fC A O １b e t w e e nw i l d Ｇt y pe a n d t h em u t a n t．A－野生型;B －突变体.A ,W i l d Ｇt y pe ;B ,M u t a n t ．图５㊀野生型和突变体C A O １蛋白三维模型的拉氏构象F i g．５．R a m a c h a n d r a n p l o t s o f ３D p r o t e i n s t r u c t u r em o d e l s o f C A O １i n t h em u t a n t a n d i t sw i l d Ｇt y pe ．５Ｇ二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基的基因R b c L ,编码核酮糖Ｇ１,５Ｇ二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基的基因R b c S ,编码原叶绿素酸酯氧化还原酶A 的基因O s ＧP O R A ,编码原叶绿素酸酯氧化还原酶B 的基因O s P O R B ,编码叶绿素合成酶的基因Y G L １,编码类胡萝卜素异构酶的基因O s C R T I S O (Z L ２).如图６显示,除类胡萝卜素合成途径中编码催化顺式番茄红素到全反式番茄红素转变的关键酶的基因O s ＧC R T I S 在野生型与突变体中存在临界差异外(P ＝０．０３６７),其余基因均未检测到显著性差异.３㊀讨论本研究采用图位克隆法,将来自籼稻中恢８０１５的黄绿叶突变体w ３９０精细定位至第１０染色体长臂大约７１．８k b 的基因组区域内.序列比对发现,位于该区域的O s C A O １在第１１８１和１１８４位(第８外显子)的碱基发生了突变,相应的地发生了两个氨基酸的突变.O s C A O １编码叶绿素酸酯氧化酶１(C A O １),是催化叶绿素a 向叶绿素b 转化的关键酶,该酶的失活将严重阻碍叶绿素b 的合成[２０Ｇ２１].而本研究的实验材料w ３９０中检测不到叶绿素b 的存在,由此,我们推测w ３９０是一个O s C A O １新的等位突变体.此外,w ３９０中叶绿素a 和类胡萝卜素含量显著降低,叶绿体超微结构异常,这与O s C A O １发生突变后引起的表型变异也是一致的[２０Ｇ２１].C A O １蛋白存在两个重要的结构域:R i e s k e 铁硫配位中心(R i e s k e _２F e Ｇ２S )和单核非血红素铁结合位点(P a O ),分别位于２１３－３２８氨基酸和４０８－５０６氨基酸,二者的氧化还原活性对C A O １具有重要作用[２０Ｇ２１].突变体w ３９０中,叶绿素b 含量降为零,这表明突变体中C A O １蛋白完全失活;但其突变发生在第３９４和３９６位氨基酸,并不位于R i e s k e _２F e Ｇ２S 和P a O 这两个功能结构域中.为了分析突变体中突变蛋白失活的原因,我们进行了蛋白三维结构的预测.结果显示,与野生型相比,突变体的C A O １蛋白不但发生突变的第３９４和３９６位氨基酸所在区域(３８２－３９６位氨基酸)的结构发生改变(图４,野生型与突变体中分别以红色和蓝色表示),与其在三维空间上相邻的４２３－４３２位氨基酸的结构也发生了改变,而后者位于保守结构域P a O (图４,野６４２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i )㊀第２９卷第３期(２０１５年５月)图６㊀实时荧光定量P C R分析野生型与突变体中叶色相关基因的表达F i g．６．E x p r e s s i o na n a l y s i s o f g e n e s a s s o c i a t e dw i t h l e a f c o l o r b y r e a lＧt i m eP C R i n t h em u t a n t a n d i t sw i l dＧt y p e．生型与突变体中分别以紫色和浅蓝色标示)中.这可能是因为第３９４位由非极性疏水的亮氨酸突变为碱性的组氨酸,第３９６位由非极性且构象灵活的小氨基酸甘氨酸突变为酸性的谷氨酸;影响了相邻氨基酸(不仅在一级结构相邻的氨基酸,而且在三维空间结构上相邻的氨基酸)之间的非共价键,在空间上限制了肽链折叠,从而使得P a O正常折叠存在空间障碍,最终导致突变体中C A O１蛋白功能失活.C A O１催化叶绿素a向叶绿素b的转化过程.但w３９０中检测不到叶绿素b的存在,叶绿素a和类胡萝卜素含量也显著降低,同时w３９０中叶绿体结构也出现异常.于是我们检测了野生型和突变体中与光合色素的合成与降解㊁色素结合蛋白以及叶绿体的发育相关基因的表达水平.结果表明除编码类胡萝卜素异构酶的基因O s C R T I S O的表达可能降低(P＝０．０３６７)外,其余１３个基因的表达水平与野生型无显著性差异.这说明O s C A O１的突变未在表达水平上对光合色素的合成与降解㊁各类色素结合蛋白以及叶绿体的发育产生影响.前人报道,叶绿素b对L H CⅡ的稳定性有很重要的作用[３３],叶绿素b的缺失将导致植株不能积累足够的补光叶绿素a/b结合蛋白[３４],类囊体的垛叠方式也发生变化[３５].所以w３９０中叶绿素a和类胡萝卜素含量的降低㊁叶绿体结构的异常可能是由于叶绿素b的缺７４２董青等:水稻黄绿叶突变体w３９０的遗传分析和基因定位失后叶绿体稳定性降低造成的.叶绿素a在C A O１的催化下形成叶绿素b,而叶绿素b在一定的条件下也可还原为叶绿素a,但叶绿素a和叶绿素b之间的转化循环并非作为一个整体循环在同时起作用,而是根据特殊的生理需要供给叶绿素a或叶绿素b.植物潜在地利用叶绿素循环来调整叶绿素a与叶绿素b的比值以适应不同的生理和环境需要[３６],但是叶绿素循环的调控机制目前尚不清楚.本研究中,w３９０植株内叶绿素b 的合成严重受阻,同时叶绿素a含量也显著降低,叶绿素a与叶绿素b的比值发生明显变化,所以该突变体为研究叶绿素循环调控机制提供了新的遗传资源.参考文献:[１]㊀S a m u e l I B．G r e e n g e n e s g l e a n e d．T r e n d sP l a n t S c i,２００５,１０(７):３０９Ｇ３１２．[２]㊀K u s a b a M,I t o H,M o r i t a R,e ta l．R i c e N O NＧY E L L OWC O L O R I N G１i si n v o l v e di nl i g h tＧh a r v e s t i n g c o m p l e xI Ia n dg r a n ad e g r a d a t i o nd u r i n g l e a fs e n e s c e n c e．P l a n tC e l l,２００７,１９:１３６２Ｇ１３７５．[３]㊀W a n g P R,G a oJX,W a nC M,e ta l．D i v i n y l c h l o r o p h y l l(i d e)a c a nb e c o n v e r t e d t om o n o v i n y l c h l o r o p h y l l(i d e)ab y ad i v i n y l re d u c t a s e i n r i c e．P l a n tP h y s i o l,２０１０,１５３:９９４Ｇ１００３．[４]㊀Y a m a t a n iH,S a t oY,M a s u d aY,e t a l．N Y C４,t h er i c eo rＧt h o l o g of A r a b i d o p s i sTH F１,i s i n v o l v e d i n t h e d eg r a d a t i o n o fc h l o r o p h y l lＧp r o t e i n c o m p l e x e sd u r i n g le af s e n e s c e n c e．P l a n t J,２０１３,７４:６５２Ｇ６６２．[５]㊀S u g i m o t o H,K u s u m iK,T o z a w aY,e ta l．T h e v i r e s c e n tＧ２m u t a t i o n i n h i b i t s t r a n s l a t i o n o f p l a s t i d t r a n s c r i p t s f o r t h e p l a sＧt i d g e n e t i c s y s t e ma t a ne a r l y s t a g eo f c h l o r o p l a s td i f f e r e n t i aＧt i o n．P l a n tC e l lP h y s i o l,２００４,４５(８):９８５Ｇ９９６．[６]㊀K u s u m iK,S a k a t aC,N a k a m u r aT,e ta l．A p l a s t i d p r o t e i n N U S１i s e s s e n t i a l f o rb u i l dＧu p o f t h e g e n e t i c s y s t e mf o re a r l yc h l o r o p l a s tde v e l o p m e n t u n d e r c o l d s t r e s s c o n d i t i o n s．P l a n t J,２０１１,６８(６):１０３９Ｇ１０５０．㊀[７]㊀S uN,H u M L,W uDX,e t a l．D i s r u p t i o no f a r i c e p e n t a t r iＧc o p e p t ide r e p e a t p r o t e i nc a u s e sas e e d l i n gＧs p e c if i ca l b i n o p h eＧn o t y p e a n d i t s u t i l i z a t i o n t o e n h a n c e s e e d p u r i t y i nh y b r i dr i c e p r o d u c t i o n．P l a n tP h y s i o l,２０１２,１５９(１):２２７Ｇ２３８．㊀[８]㊀邓晓娟,张海清,王悦,等．水稻叶色突变基因研究进展．杂交水稻,２０１２,２７(５):９Ｇ１４．[９]㊀李贤勇,王楚桃,李顺武,等．一个水稻高叶绿素含量基因的发现．西南农业学报,２００２,１５(４):１２２Ｇ１２３．[１０]J u a n M P,M a ríaCS,K e r s t i nK,e t a l．R i c e N T R C i s a h i g hＧe f f i c i e n c y r e d o xs y s t e mf o r c h l o r o p l a s t p r o t e c t i o na g a i n s to x iＧd a t i ve d a m a g e．P l a n tC e l l,２００６,１８(９):２３５６Ｇ２３６８．[１１]M i y o s h iK,I t oY,S e r i z a w aA,e t a l．O s HA P３g e n e s r e g u l a t ec h l o r o p l a s t b i o g e n e s i s i n r i c e．P l a n t J,２００３,３６(４):５３２Ｇ５４０．㊀[１２]D o n g H,F e iGL,W uCY,e t a l．Ar i c e v i r e s c e n tＧy e l l o w l e a f m u t a n t r e v e a l s n e w i n s i g h t s i n t o t h e r o l e a n d a s s e m b l y o f p l a sＧt i d c a s e i n o l y t i c p r o t e a s ei n h i g h e r p l a n t s．P l a n t P h y s i o l,２０１３,１６２(４):１８６７Ｇ１８８０．㊀[１３]Z h a oCF,X u JM,C h e nY,e t a l．M o l e c u l a r c l o n i n g a n d c h a rＧa c t e r i z a t i o no f O s C H R４,ar i c ec h r o m a t i nＧr e m o d e l i n g f a c t o rr e q u i r e df o re a r l y c h l o r o p l a s td e v e l o p m e n ti na d a x i a l m e s oＧp h y l l．P l a n t a,２０１２,２３６(４):１１６５Ｇ１１７６．㊀[１４]L i u W Z,F uYP,H uGC,e t a l．I d e n t i f i c a t i o n a n d f i n em a pＧp i n g o f a t h e r m oＧs e n s i t i v e c h l o r o p h y l l d e f i c i e n tm u t a n t i nr i c e (O r y z a s a t i v a L．)．P l a n t a,２００７,２２６(３):７８５Ｇ７９５．[１５]T s u g a n eK,M a e k a w a M,T a k a g iK,e ta l．A na c t i v eD N A t r a n s p o s o n n D a r t c a u s i n g l e a f v a r i e g a t i o na n dm u t a b l ed w a r fＧi s ma n d i t sr e l a t e de l e m e n t s i nr i c e．P l a n tJ,２００６,４５(１):４６Ｇ５７．㊀㊀[１６]G o t h a n d a m K M,K i m ES,C h oH,e t a l．O s P P R１,a p e n tＧa t r i c o p e p t i d e r e p e a t p r o t e i no f r i c e i se s s e n t i a l,f o r t h ec h l o r oＧp l a s t b i o g e n e s i s．P l a n tM o lB i o l,２００５,５８:４２１Ｇ４３３．[１７]G o hC H,J u n g K H,R o b e r t sSK,e t a l．M i t o c h o n d r i a p r oＧv i d e t h e m a i ns o u r c eo fc y t o s o l i c A T Pf o ra c t i v a t i o no fo u tＧw a r dＧr e c t i f y i n g K＋c h a n n e l s i nm e s o p h y l l p r o t o p l a s t o f c h l o r oＧp h y l lＧd e f i c i e n t m u t a n t r i c e(O s C H L H)s e e d l i n g s．J B i o lC h e m,２００４,２７９:６８７４Ｇ６８８２．[１８]Z h a n g H T,L i J J,Y o o JH,e t a l．R i c e C h l o r i n aＧ１a n d C h l oＧr i n aＧ９e n c o d eC h l Da n dC h l I s u b u n i t so fM gＧc h e l a t a s e,ak e ye n z y m ef o r c h l o r o p h y l l s y n t h e s i s a n d c h l o r o p l a s t d e v e l o p m e n t．P l a n tM o lB i o l,２００６,６２(３):３２５Ｇ３３７．[１９]S a k u r a b aY,R a h m a n M L,C h oS H,e ta l．T h er i c e f a d e dg r e e n l e a f l o c u se n c o d e s p r o t o c h l o r o p h y l l i d eo x i d o r e d u c t a s eBa n d i s e s s e n t i a l f o r c h l o r o p h y l l s y n t h e s i s u n d e r h i g h l i g h t c o nＧd i t i o n s．P l a n t J,２０１３,７４(１):１２２Ｇ１３３．[２０]L e eS,K i m J H,Y o oE S,e ta l．D i f f e r e n t i a l r e g u l a t i o no fc h l o r o p h y l l a o x y g e n a s e g e n e s i nr i c e．P l a n tM o lB i o l,２００５,５７(６):８０５Ｇ８１８．[２１]杨海莲,刘敏,郭旻,等．一个水稻黄绿叶突变体y g l１０的遗传分析和基因定位．中国水稻科学,２０１４,２８(１):４１Ｇ４８．[２２]L i J,L o n g Y,Q i G N,e t a l．T h eO sＧA K T１c h a n n e l I s c r i t i c a lf o rK＋u p t a k e i n r i c e r o o t s a n d i sm o d u l a t e d b y t h e r i c eC B L１ＧC I P K２３c o m p l e x．P l a n tC e l l,２０１４,８０:３００Ｇ３０７．[２３]W uZ M,Z h a n g X,H eB,e t a l．Ac h l o r o p h y l lＧd e f i c i e n t r i c e m u t a n tw i t hi m p a i r e dc h l o r o p h y l l i d ee s t e r i f i c a t i o ni nc h l o r oＧp h y l l b i o s y n t h e s i s．P l a n tP h y s i o l,２００７,１４５(１):２９Ｇ４０．㊀[２４]M o r i t aR,S a t oY,M a s u d aY,e t a l．D e f e c t i n n o nＧy e l l o wc o l oＧr i n g３,a nα/βh y d r o l a s eＧf o l df a m i l yp r o t e i n,c a u s e sas t a yＧg r e e n p h e n o t y p e d u r i n g l e a f s e n e s c e n c e i n r i c e．P l a n t J,２００９,５９(６):９４０Ｇ９５２．[２５]J i a n g H W,L iM R,L i a n g N T,e t a l．M o l e c u l a r c l o n i n g a n df u n c t i o na n a l y s i s o f t h e s t a yg r e e n g e n e i n r i c e．P l a n t J,２００７,５２(２):１９７Ｇ２０９．８４２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第２９卷第３期(２０１５年５月)[２６]F a n g J,C h a iCL,Q i a nQ,e t a l．M u t a t i o n so f g e n e s i ns y nＧt h e s i s o f t h e c a r o t e n o i d p r e c u r s o r s o fA B Al e a d t o p r eＧh a r v e s t s p r o u t i n g a n d p h o t oＧo x i d a t i o n i n r i c e．P l a n tJ,２００８,５４(２):１７７Ｇ１８９．[２７]L iZ,Z h a n g Y X,L i uL,e ta l．F i n e m a p p i n g o f t h e l e s i o n m i m i c a n de a r l y s e n e s c e n c e１(l m e s１)i nr i c e(O r y z as a t i v aL．)．P l a n tP h y s i o lB i o c h e m,２０１４,８０:３００Ｇ３０７．[２８]S A S I n s t i t u t e I n c,S A S/S T A T U s e r sG u i d e．S A SI n s t i t u t e,C a r y,N C,U S A,１９９９．[２９]R o g e r s SO,B e n d i c hAJ．E x t r a c t i o no fD N Af r o m m i l l i g r a ma m o u n t so ff r e s h,h e rb a r i u m a n d m u mm i f i e d p l a n tt i s s u e s．P l a n tM o lB i o l,１９８５,５:６９Ｇ７６．[３０]O r j u e l a J,G a r a v i t oA,B o u n i o lM,e t a l．Au n i v e r s a l c o r e g eＧn e t i cm a p f o r r i c e．T h e o rA p p lG e n e t,２０１０,１２０:５６３Ｇ５７２．[３１]R y c h l i k W．O l i g oP r i m e rA n a l y s i sS o f t w a r eV e r s i o n７．０．２n de d．M o l e c u l a rB i o l o g y I n s i g h t s,I n c,C a s c a d e,C O,２００８．[３２]刘胜,魏祥进,邵高能,等．一个水稻 斑马叶 叶色突变体基因z e b r a l e a f２(z l２)的图位克隆．中国水稻科学,２０１３,２７(３):２３１Ｇ２３９．[３３]Y a m a s a t o A,N a g a t a N,T a n a k aR,e ta l．T h e NＧT e r m i n a ld o m a i no f c h l o r o p h y l l i de ao x y g e n a s e c o nf e r s p r o t e i n i n s t a b i l iＧt y i nr e s p o n s et oc h l o r o p h y l lba c c u m u l a t i o ni n A r a b i d o p s i s．P l a n tC e l l,２００５,１７:１５８５Ｇ１５９７．[３４]H a r r i s o nM A,N e m s o n JA,M e l i sA．A s s e m b l y a n d c o m p o s iＧt i o no f t h ec h l o r o p h y l l aＧbl i g h tＧh a r v e s t i n g c o m p l e xo fb a r l e y(H o r d e u mv u l g a r e L．):I mm u n o c h e m i c a l a n a l y s i so f c h l o r oＧp h y l lbＧl e s s a n d c h l o r o p h y l lbＧd e f i c i e n t m u t a n t s．P h o t o s y n R e s,１９９３,３８:１４１Ｇ１５１．[３５]S t a e h e l i nL A．C h l o r o p l a s ts t r u c t u r ea n ds u p r a m o l e c u l a ro rＧg a n i z a t i o no f p h o t o s y n t h e t i cm e m b r a n e s//P i r s o nA,Z i mm e rＧm a n n M H．E n c y c l o p e d i a o f P l a n t P h y s i o l o g y．B e r l i n:G e r m aＧn y:S p r i n g e rＧV e r l a g,１９８６:１Ｇ８４．[３６]Rüd i g e rW．B i o s y n t h e s i so f c h l o r o p h y l l ba n dt h ec h l o r o p h y l lc y c l e．P h o t o s y nR e s,２００２,７４:１８７Ｇ１９３．９４２董青等:水稻黄绿叶突变体w３９０的遗传分析和基因定位。