文献译文一个水稻黄绿叶突变体的基因定位Peng Du1, Ying-Hua Ling1, Xian-Chun Sang1, Fang-Ming Zhao1, Rong Xie2, Zheng-Lin Yang1 and Guang-Hua He1*1Rice Research Institute, Key Lab of Biotechnology and Crop Quality Improvementof the Agricultural Ministry, Southwest University,Chongqing 400715, P. R. China2Rice and Sorghum Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Luzhou, Sichuan 646000, P. R. ChinaReceived October 16, 2008; accepted February 27, 2009摘要：在对籼稻恢复系缙恢10（Jinhui10）进行EMS诱导所获得的突变群体中，鉴定得到了一个的黄绿叶突变体。

生长阶段表现出完全的黄绿叶片形态，低叶绿素含量表达和农艺性状欠佳。

正常的植株和突变体杂交得到F1代群体，其表现出正常的绿色叶片；在F2群体中，正常叶色和黄绿叶分离比为3:1。

证明该突变性状由一对单隐性核基因控制，暂时命名为ygl3。

ygl3基因定位在第3染色体上，位于标记RM4468和RM3684之间，遗传距离分别为8.4cM和1.8cM。

这个结果将应用到遗传信息精细定位和图位克隆中。

关键字：水稻，黄绿叶突变体，叶绿素，荧光动力学参数前言作物生物量和经济产量主要是依靠叶片的光合作用的同化作用，比如水稻中大约有90%的干物质是通过光合作用积累的。

叶绿素是捕获光能的主要色素，而黄化和白化突变通常会影响叶绿素的生物合成和降解。

叶绿素缺乏突变体也常被看作是叶色突变体。

这些突变体广泛地应用在叶绿素的生物合成和降解、叶绿体的发育、四吡咯（注：广泛存在于叶绿素a中）合成途径和光合作用机制方面的研究(Mochizuki et al., 2001; Larkin et al., 2003; Davison et al., 2004;Stern et al., 2004; Beale, 2005)。

叶色突变也常作为种子纯度鉴定和高光效育种的标记(Dong et al.,1995; Wu et al., 2002; Sato et al., 2007)。

许多叶片黄化突变体已经在很多植物中发现，如玉米、小麦、油菜、胡萝卜、拟南芥中。

研究发现在拟南芥中，至少有27个基因编码15种参与叶绿素生物合成中的酶（(Nagata et al., 2005)）。

突变基因是引起叶片黄化的关键原因。

水稻是单子叶模式植物，也是世界上最重要的作物，有关于水稻叶色突变现象的研究已经吸引了越来越多研究者的注意(Wang et al., 2006)。

在水稻突变体基因鉴定中，图位克隆是最有效最可靠的方法。

现今，已有超过70种水稻叶色突变体被报道出来，其中至少10个相关基因被定位在染色体或连锁群上，其中的一些基因已经被克隆出来了（Jung et al., 2003; Lee et al.,2005; Wu et al., 2007）。

本研究报道了一个黄绿叶突变体ygl3，是通过EMS诱变处理恢复系缙恢10发现的。

突变体的叶绿素含量、叶绿素荧光动力学参数、农艺特性已经在研究了，突变体控制叶片黄化的基因已经通过对F2代群体进行连锁分析和利用SSR标记进行基因分型，得出的结作为给突变体基因图位克隆的基础，并应用在育种中。

材料和方法植物材料籼稻缙恢10是一个优良的恢复系，广泛的应用到水稻的杂交制种。

一个黄绿叶突变体ygl3，来自经过EMS处理过的缙恢10，连续自交5代选择性育种。

从F1代杂交种和经过5代杂交获得的F2群体建立遗传分析：西农1A×ygl3，西农1B×ygl3，ygl3×西农1B，II-32B×ygl3，and ygl3×II-32B。

调查发现从3叶阶段出现黄绿叶。

光合色素含量检测每15天用移植后的的新鲜叶子混合后测色素含量。

浸提物的检测和计算参照Lichtenthaler描述的方法。

净光合速率和叶绿素荧光动力学参数的测定便携式LI-6400测量仪用来测定晴天中从8：30到10：00分蘖期倒二叶的净光合速率（Pn）。

叶绿素荧光动力学参数的测定用安装有6400-02光源的便携式LI-6400测量仪。

每种材料重复三次测定。

农艺特性实验在成熟期，挑选10个突变体材料用来测定农艺特性，包括材料有效穗数、株高、主穗长、一次枝梗数、主穗重、千粒重、结实率，数据用DPS3.01系统分析。

DNA提取西农1A×ygl3杂交的F2代，作为定位群体。

从1122株F2突变体植株的选取新鲜幼嫩的用碱提取法群体DNA（Sang et al.,2006）。

基因池DNA的分离用改良CTAB法（Murray and Thompson,1980）。

SSR分析微卫星引物序列从/microsat/and synthesized中查找，由上海生工生物工程有限公司合成。

SSR标记用到的PCR反应体系和罗等人(Luo et al .，2007)描述的一致。

PCR产物经10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳法，快速银染后显色观察。

基因定位将具有西农1A带型的单株和ygl3带型的单株分别记为A和B，杂合子带型的单株记为H。

用MAPMARKER/EXR3.0b版进行连锁分析，用Kosambi 函数将重组率转化为遗传距离(cM)。

农艺特性ygl3突变体秧苗表现出很明显的黄绿叶和生长过程中发育不良的特性，尤其是在分糵期的表现（图1）。

突变体农艺特性有着很明显的改变，尤其是有效穗数和主穗重分别只有野生型亲本的30%～40%（表1）。

图1 ygl3突变体和野生型亲本分蘖期和抽穗期的表型(a) 野生型亲本缙恢10和ygl3突变体分蘖期的表型；(b) 野生型亲本缙恢10和ygl3突变体抽穗期的表型；(c) 野生型亲本缙恢10和ygl3突变体田间表现。

表1 ygl3突变体和野生型亲本缙恢10主要农艺性状表现材料有效穗株高（cm）主穗长（cm）一次枝梗数（cm）主穗重（g）千粒重（g）结实率（%）缙恢10 19.3 102.6 27.4 18.3 7.2 27.5 86.9 ygl38.3 82.3 21.5 13.0 2.1 24.1 61.1ygl3突变体的叶绿素含量ygl3的叶绿素a与叶绿素b含量的比值为4.02～8.91，高于野生型亲本的2.00～2.14。

在ygl3生长发育期间，前60天的叶绿素a与叶绿素b的比值明显高于移植后的后60天。

对比野生型亲本，ygl3突变体的叶绿素含量明显减少，包括叶绿素a 和叶绿素b、总叶绿素（图2）。

ygl3总叶绿素含量（平均在1.09mg/g）比野生型亲本（平均3.26mg/g）少多了。

图2 叶绿素含量在不同发育期的分析-◆-代表野生型亲本缙恢10，-X-代表ygl3净光合速率和叶绿素荧光动力学参数对比野生型亲本，ygl3突变体在分蘖期的净光合速率（Pn）降低14.5%（表2），同时显示突变体保持着相当高的光合能力。

与突变体叶绿素含量减少相符合的是，ygl3突变体初始荧光（F0）是野生型的31.3%（表2）。

光化学抑制参数（qP）在突变体和野生型有一点点改变，对比野生型光合作用系统II（PSII）的最大光化学量子产量（Fv/Fm）为0.8，突变体的是0.65。

实际有效的PSII(Y)和电子传递速率（ETR）是0.25和0.40，然而野生型的分别是0.46和0.79。

结果表明突变体基因在PSII会有光抑制。

我们推断突变体ygl3光合作用和光合体系受到影响是因为它的基因作用。

表2 ygl3和野生型亲本的叶绿素荧光动力学参数材料PnFv/Fm qP Y ETR F0 (μmol·m-2·s-1)缙恢10 26.9 0.80 0.67 0.46 0.79 65.35ygl323.0 0.65 0.60 0.25 0.40 20.45遗传分析5个杂交组合的F1群体显示的是和野生型亲本一样的绿色。

F1群体和野生型亲本缙恢10之间叶绿素含量没有明显的变化，F2群体中绿叶和黄绿叶分离比符合3：1比率（表3）。

这个结果可以确定在ygl3突变体中黄绿叶表型是单隐性核基因控制。

表3 ygl3突变体遗传分析杂交组合F1F2植株数F2绿色（株）F2黄化（株）X2(3：1) P值西农1A /ygl3绿色4522 3400 1122 0.08 0.75-0.90 西农1B/ygl3绿色602 446 156 0.22 0.50-0.75 ygl3 /西农1B 绿色583 433 150 0.17 0.50-0.75 II-32B/ygl3绿色550 421 129 0.70 0.25-0.50 ygl3/ II-32B 绿色806 600 206 0.11 0.50-0.75基因定位选自西农1A和ygl3杂交所得的F2群体，确定为ygl3基因分子连锁标记的材料。

选用400 对均匀分布于12 条染色体上的微卫星标记对亲本西农1A和ygl3进行多态性分析,具有多态性的标记100 对, 多态性频率25%。

这个可能是因为亲本遗传关系较远所致，同时这个F2群体可以利用来进行基因定位。

对大量DNA分离分析，从F2群体中获得的10个独特的黄绿叶基因组DNA和10个绿色的基因组DNA分别混合后建立突变基因池(MP)和正常基因池（WP）。

在亲本之间多态性引物中，突变基因池(MP)和正常基因池（WP）仅仅检测到两对引物RM1230和RM1221（图3）有多态性。

同时，结果支持这两个标记可能与ygl3突变体的黄绿叶有关基因有连锁关系。

分析F2群体中的1122株隐性黄绿叶植株进一步确认了连锁关系，隐性基因位置在RM1230和RM1221之间，遗传距离分别是相距13.4cM和5.8cM。

图3 SSR标记RM1230与突变体位点连锁验证1，西农1A；2，ygl3；3，正常池；4，突变池；5-12,F2群体中正常植株；13-20,F2群体中突变植株。

为进一步定位ygl3基因，分析了另外在RM1230和RM1221之间的13对SSR引物。

结果发现在西农1A和ygl3群体之间两个标记RM468和RM3684存在多态性，分别相距8.4cM和1.8cM（图4）。

图4 ygl3在第3染色体上的基因定位讨论水稻是单子叶模式植物，随着其基因组测序的完成,水稻功能基因研究愈来愈引起人们的关注。