放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。
腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。
放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。
1.拮抗放线菌的筛选方法：
1.1平板划线法：
待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。
如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。
可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。
选择抑制活性强的复筛。
1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法
将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。
若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。
若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。
1.3纸片法或生长速率法：
主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测
发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有
无抑菌圈或抑菌圈的大小。
2.放线菌分离与筛选.
2.1培养基；
2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）
3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。
2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基
2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速
度迅速。
重铬酸钾50-75ug/ml(150ug/ml为宜)或另添加1-2ug/ml青霉素，可
显著抑制细菌和真菌生长，不影响放线菌的数量和种类。
2.3靶标菌：枯草杆菌大肠杆菌金黄葡萄球菌八联球菌变形
杆菌
2.4放线菌分离与筛选
2.4.1传统的分离筛选思路；
以对某些如病原菌或杂草，昆虫为靶标的抑制和杀灭效果为标准筛选
产生活性物质的放线菌，即筛选拮抗放线菌。
初筛：将分离得到菌株进行真对靶标抑制活性筛选。
优点：较早知道是否筛选到拮抗菌株，筛选范围广。
缺点：方法粗放，
浪费很多初始条件下不显示活性的菌种。
复筛：对初筛的阳性菌株进一步改进，便于有效筛选出针对靶标的菌株。
2.4.2样品（土壤）处理：风干或加热是在杂菌抑制中较常见预处理方法。
室温风干处理得到的放线菌种类和数量均高于加热处理。
室温风干10d和20d放线菌数量无明显变化。
2.4.3放线菌分离与纯化
无菌条件下取1.0g风干土壤样品置于99mL/150mL三角瓶中（有时加入10-15滴10℅苯酚），振荡20-30min，然后将悬液梯度稀释至10-6，取0.1mL梯度液涂布于含重铬酸钾培养基上，28℃ 5-7d，挑选生长快的不同的菌落进行划线分离纯化（镜检）至纯培养物，转接于斜面保存（甘油法 -20℃冷冻保藏）。
附：放线菌菌落硬度大，干燥致密与基质结合紧密，不易挑取。
培养箱中放置一杯水以增加湿度，平板相对厚些，避免过找干涸。
如将材料干燥。
高温。
低温处理并改变培养温度和培养基成分，得到不同放线菌。
2.4.4筛选（拮抗试验）：
2.4.4.1初筛：
牛津杯法：24h摇瓶靶细菌悬浮液均匀涂布于平板，中央放置牛津杯，在牛津杯（内径6mm，外径8mm）中分别加试验菌发酵液0.15mL和无菌发酵液0.15mL，30℃ 2-3d，观察是否有抑菌圈产生，并测抑菌圈的直径，阴性对照：无菌水。
对峙培养法（初筛）：PDA平板以圆点为中心划一条直线，中心点接放线菌培养3d后，直线的两端距中心相同距离接同一病原菌。
培养一定时间，是否有抑菌圈产生，有抑菌圈的测量抑菌圈的相对半径（抑菌圈的半径—放线菌菌落半径），选择拮抗好的放线菌进入复筛。
琼脂扩散法（初筛）：分离纯化种接种到改良黄豆粉琼脂培养基上，28℃ 7-8d，用打孔器打成直径5mm琼脂块。
取指示菌0.1mL涂布于普通琼脂平板，挑取琼脂块反贴到指示菌平板上，（鳗弧菌肠型点状气单胞菌28℃培养，大肠和金黄葡萄糖球菌37℃培养，24h后）观察抑菌圈和测量。
2.4.4.2复筛：将初筛有较强抗菌作用的放线菌株接种于改良黄豆粉液体培养基中，28℃ 140r/min 7-8d。
取指示菌0.05mL涂布于普通琼脂平板上，用灭菌的打孔器在培养基上打孔，取放线菌培养液0.05mL注入孔中，培养24-48h后进行抑菌观察和测量。
2.4.5初步鉴定：
2.4.5.1菌落特征和形体特征
接种于高氏1号培养基上，插片，28℃培养3 5 7 10 15d，取出插片进行观察，气生基内菌丝以及是否产生横隔断裂等特征，并观察它们的生长情况，气生和基内菌丝颜色，作为分类的依据。
2.4.5.2生理生化试验：
进行明胶液化牛奶凝固和胨化硝酸盐还原淀粉水解硫化氢产生等试验。
菌株明胶液化牛奶凝固牛奶胨化硝酸盐还原淀粉水解硫化氢产生1. + + + + - -
2. + + - - + -
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