高效液相色谱法应用时经常出现的问题
※ 液相色谱仪：绝不建议为节约乙腈/甲醇，而采
用两个泵，将水相与有机相分别注入混合的方式 （即便配臵了脱气机）。一定要将两相按比例混合 后脱气过滤，采用一个泵注入，且清洗时一定就清 洗使用泵，不建议采用另一个泵将清洗液注入（重 点讲述！） ※ 过滤膜一定要采用混相膜。
试验结束后切勿立即切断电源，设臵为室温，使
其自然降温，之后再关闭电源。
熔距越短或终熔点越接近高限、纯度越高。
【紫外-可见分光光度法】
比色法测定时、一定要平行操作，测定时迅即完
成，切忌等待吸收度值稳定后再行记录！
【旋光度测定法】 温控尤为重要！先将溶剂臵于该温度水浴中，随 后采用该溶剂快速配制溶液，定容后立即测定。 【氧瓶燃烧法】 样品一定要燃烧完全。若氧气充满、尚无法燃尽，
线性试验
主成分含量测定 以测定浓度为100% ，
50%~120%之间选取5个点即可。
溶出（释放）度测定 以释放量的10%～120% 间选取5个点即可。 杂质含量用杂质对照品准确测定 以杂质限度 为100% ，50%~120%之间选取5个点即可。
测定结果： 1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。 2）误差在哪里，应用时的注意事项。 3）为什么没有不成线性的？通常C、H、O、 N结构，紫外监测器决定。 个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会出 现不成线性。 4）都成线性、为何还要做？最小二乘法的 原理知晓。何种情况不呈线性？
★ 强烈建议男同志从事此项工作。
★ 将对照品溶液浓度配制为限度点。
★ 对于二氯甲烷、三氯甲烷采用氢火焰检测器(FID)勉 为其难、应采用电子捕获检测器(ECD)。如要强行检 测，可采用的办法有：直接进样、加大流速，使峰 形便尖锐、从而提高峰面积积分精密度。 ★ 供试品溶液一定要全部溶解。 ★ 对于一些高沸点和低沸点的残留溶剂，不推荐采用 顶空法进样！
容量分析法测定含量
(4) 操作中的注意事项
对于采用指示剂法测定的操作，只要有空白试验，样 品变色后的色泽一定要与空白色泽一致，以消除系统误 差。 (5) 容量分析法与HPLC法介绍（引申至对照品质量标准） ☆ 容量分析法：专属性差、人为因素较强；但省时省力。 ☆ HPLC法：专属性强；但定量结果会因波长不同存在 较大偏差，因杂质与主成分的响应因子不同
高效液相色谱法应用时经常出现的问题
※ 柱温箱一定要配制。试验温度建议在30-50℃。 清洗温度可高于试验温度5℃。 ※ 色谱柱清洗：
对于正相、实验结束用流动相再冲洗半小时即可。 对于反相，除非流动相采用单纯的甲醇/乙腈-水，其他所 有流动相皆建议先用纯水冲洗半小时（流速1.0ml/min），再 改用20%甲醇冲洗半小时，随后取下、两头密闭即可。绝不 推荐……
薄层色谱法测定有关物质
(1) 尽可能使用商品化薄层板、不建议自行铺制。
(2) 设臵梯度对照(1.0%、0.5%、0.2%和0.1%，通过点样
量来实现，方便快捷、事半功倍)；实现“半定量”。
(3) 0.1%斑点如显现不出，加大点样量。
(4) 主斑点如超载、“断腰”，可适当减小点样量。
(5) 显色剂尽可能新鲜配制。
(6) 观测时，建议增加翻转观测，即透过玻璃面观测。
高效液相色谱法测定有关物质
(1) 每批样品配制1份，即可。 (2) 多批样品同时检测时，选用粉末量最少的样品 稀释制成自身对照溶液即可，绝对无需每一样品均 稀释成自身对照溶液。 (3) 对照溶液连续进样3针，计算主峰峰面积的RSD， 小于2.0%即认为仪器稳定、积分无误。取峰面积均 值用于样品杂质峰比较。
已知杂质、且有杂质对照品的，可采用
加入法，即加样回收率来评价。
一般情况下，只要空白辅料无干扰，回
收率均是良好的！
专属性
有关物质为主，其他检测项目（含量）基 本上均参照有关物质。
有关物质的验证，采用中间体和降解产物
（确认结构后人工合成）来验证与主成分的
分离。
详述强破坏试验的宗旨与内涵！
● 系统适用性试验用溶液配制法
高效液相色谱法应用时经常出现的问题
※ 梯度洗脱时，必须先行测定空白溶剂峰， 应基线平稳、溶剂峰出峰在前。确认色谱柱 内清洗干净后再测定样品。
以确保有关物质检测时，杂质的准确测定。
高效液相色谱法测定含量
(1) 对照品溶液配制2份（2份粉末） 分别进样3针，
计算校正因子f=C/A，随后计算f的RSD，小于2.0%
精密度试验
重复性试验：连续进样6次。 中间精密度试验和重现性试验通过“耐用 性试验中的溶液稳定性试验”来体现。 浓度极低时才会不理想，加大进样量。 色谱峰形极为重要，对称性、柱效等参数。 加大柱温、增加流动相中有机相比例，使被 测物质峰尽快出峰。
准确度试验
用回收率来衡量
作法：在80%~120%间选择3点或5点， 原因是由外标一点法决定的。
※ 正相流动相无需过滤、混合均匀后超声即可。
高效液相色谱法应用时经常出现的问题
※ 梯度洗脱时——
最理想方式： A相位高比例的水相兑低比例的有机相；B 相为低比例的水相兑高比例的有机相； 其次：A相位高比例的水相兑低比例的有机相；B相皆为有 机相。 绝不建议A相位纯水相、B相位纯有机相，即便质量标准如 此拟定，采用一元一次函数，将其转换成第二种情况，否则 极易出现基线飘动、无法准确积分的现象。
可将样品量减半，在其后的测定中再将浓度增加一
倍，即可。
【溶液的澄清度与颜色、氯化物、硫酸盐、重金属检查等】
建议配制梯度对照液，这样可对样品进行一个全 面、综合分析。 【炽灼残渣检查法】 炽灼后放臵于干燥器内的时间不得少于1小时，否 则称重不稳。 【崩解时限】 胶囊剂有时会出现胶囊壳存留于网底的情况，可 将囊壳取出，若其中无内容物，亦可判断为合格。
电位滴定法测定含量
☆ 对于指示剂变色难以辨明时
☆ 样品溶液变色存在干扰（有辅料或沉淀存在等） ☆ 消耗体积很少、无法采用滴定管定量。 ☆ 杂质和主成分对照品的标化方法。 ☆ 设定的滴定参数应使滴定曲线呈现平滑，以避免滴 定终点的误判。即如何确定合适的“阈值”：先全程 滴 定，根据突跃变化情况，确定阈值后再次滴定，尤其 是进行两个突跃点的滴定时（引申至新版药典）。
前处理极为繁琐、较易损失时。
含量测定浓度和色谱条件如何建立
浓度不要与有关物质浓度一致；一般为1/10～1/50。
便于过滤（对于制剂）、杂质干扰减少、积分准
确。
色谱条件可与有关物质不一致（如有关物质为梯
度洗脱或保留时间很长），更加科学化、人性化。
波长不是最大吸收波长亦可、选用末端吸收。
要注意样品粉末占有一定体积时引起的误差。
唑 来 磷 酸 结 构 式
不呈线性情况： 1）分子结构式怪异，如唑来膦酸。 2）梯度洗脱，所以此时规定柱效无意义。 3）主成分在色谱柱上几乎无保留，保留时 间为“死时间”（如氢溴酸右美沙芬的测定） 4）浓度过高时、检测器或色谱柱超载。
引申使用： 1）有关物质测定 归一化法和自身对照法的 相互妙用。 2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定 为中间浓度。举例说明。 3）回收率试验为何做80%~120%即可？亦及 样品浓度与对照品浓度接近到何等程度的理 解。 4）国内只注重相关系数，不注重截距。
高效液相色谱法测定有关物质
(4) 测定空白溶剂（梯度洗脱时一定要先行测定）
(5) 每一样品进样一针，对杂质峰进行积分。积分 时注意事项：
最小峰面积：设定为对照溶液主峰面积的1/10-1/50（讲 述原理）
斜率与峰宽：与对照溶液积分参数相同。
技巧：对照溶液稀释后，若主峰面积呈线性（一般均呈 线性），归一化法计算结果与自身对照法测定结果基本一 致（相差在0.02%以内），可用归一化直接观测。
【干燥失重和水分】
(1) 一些缓慢降解的物质、不易采用恒重，规定时间。
一般105℃、3小时肯定已可以！
典型案例——盐酸西布曲明，见下。
(2) 带有结晶水的药物，尽量采用卡氏法测定。
其中的环丁基较为 “脆弱”，不断缓慢分 解。应采用卡氏法测定。
残留溶剂研究思路
★ 研究原则：合成过程中使用到的有机溶剂均需建 立测定方法、并予以研究测定。 ★ 观测样品测定结果：申报3批样品测定结果说明 工艺稳定性。 ★ 质量标准拟定原则：除第一类溶剂外、“未检出 的溶剂”可以不拟定，仅拟定最后一步重结晶溶剂。 ★ 测定方法：根据研究检测结果，质量标准方法完 全可以与研究时方法不同。
即认为2份对照品溶液配制均无误、且仪器已稳定。
取f均值测定样品。 (2) 样品溶液亦配制2份，每份进样一针，两份百分 含量差值在〒2.0%以内即可。
高效液相色谱法测定含量
(3) 待全部样品检测结束后（无所谓n针，即便运转
了一天、亦无须担忧），任取一份对照溶液回进一 针，计算含量（浓度），应在理论浓度偏差的 〒2.0%以内，便可确保检测过程中仪器性能的稳 定。 (4) 如原方法为内标法，秉承药审中心提出的“仿 产品不是仿标准”理念，一定要改为外标法！除非
★ 尽可能建立内标法、而非外标法。
气相色谱法测定时应注意事项(2)
对照品溶液配制法（引申至对照品为油状时）。 直接进样法与顶空法的优缺点比较。 定性时、多根色谱柱使用的意义。 色谱柱选择的一定要遵循“极性相似”原理。 直接法进样样品溶液后，进样针极易堵塞。自
动进样器时设定几针溶剂，冲洗时多洗几次。 试验结束后用乙醇浸泡进样针。
【溶解度】 会因结晶溶剂的不同导致结果的差异性，一般不做硬性规 定，酌情处理。只是操作时样品一定要研细后进行。
【晶型】
如研究表明：各晶型具有相同表观溶解度，或者各晶型皆 易溶于水，此时各晶型一般不会影响药物的体内生物利用度，
便无需拟定。
如各晶型具有不同表观溶解度，即有属于低溶解性的晶型， 此时则应在质量标准中拟定晶型检测。一般采用X-射线衍射