第2章大熊猫的遗传多样性2. 1 概述大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）是我国特有的珍稀动物，也是我国的国宝。

自1869年法国神甫David在四川宝兴发现并定名大熊猫以来，大熊猫的研究一直受到我国学者和国际社会的广泛关注。

尤其是近十年来，一些国内和国际兽类学会议将大熊猫列为专题进行讨论，而且还举行了以大熊猫为主题的国际学术会议。

有关大熊猫各方面的研究都取得了长足的进展。

大熊猫的进化地位是著名的难题。

总结起来有三种观点：①大熊猫属熊科。

②属浣熊科。

③应自立为一科，即大熊猫科。

我们倾向于第3种观点（Zhang，Ryder 1993）。

大熊猫的祖先最早可追溯到中新世地层中发现的禄丰始熊猫（Ailuractos lufengensis），其牙齿较小型大熊猫小（邱占祥 1989）。

裴文中（1965）认为大熊猫在早更新世为小型大熊猫（A．microta）；中更新世体型变大，为化石大熊猫（A．fovealis）；现生大熊猫则体型稍减。

王将克（1974）确定大熊猫的祖先始于晚第三纪，更新世初期成为小型大熊猫；更新世中晚期小部分个体体型增大，由于适应新的环境，发展形成大体型的巴氏亚种（A．m．baconi）；后来体型又稍减，成为现代种。

看来，随着环境的变迁，大熊猫体型经历了由小变大、又变小的过程。

大熊猫的头和身体长120～150cm，尾长约13cm，体重75～160kg。

其被毛较粗，毛里充塞的松泡髓质层较厚，有良好的保温性。

和典型的食肉类动物不同，大熊猫朝采食竹子的特化方向发展。

其牙不像食肉的猛兽尖利，也缺乏食肉齿。

但其臼齿磨面不平整，呈现明显的高峰低谷，说明它们在一定程度上还保留其祖先食肉的咀嚼能力。

大熊猫一般栖息于海拔1400～3 600m的各种植被类型的竹林里，地形多属各分支沟源头坳沟，尤以流水切割线的夷平面、平缓上升的山脊和平台（胡锦矗 1990）较多。

大熊猫的食物主要是高山和亚高山的各种竹类，其食物的99％由竹笋、竹叶和竹秆组成；除主食竹子外，偶尔也食其他一些植物；在食物缺乏的情况下，还可食一些动物。

由于竹子各部分所含的干物质和灰分在一年中略有变化，故大熊猫在选择竹子的食用部位上也有季节性变化。

大熊猫一年四季都生活在竹林中，活动时移动的距离较短，平均每天的直线距离不到555m，其巢域仅为3 . 9～6 . 4km2（胡锦矗 1990）。

大熊猫为独栖型，但在发情和哺乳期也发生社会联系。

大熊猫在更新世时曾广泛分布于我国东部16个省市，南至缅甸和越南北部。

全新世时，在我国广西、河南等地区发现其化石。

在历史上的文字记录中，河南、湖北、湖南、贵州和云南等地也有其残存的分布点。

由于受人类社会经济活动、环境的变迁和栖息地的急剧减小等因素的影响，现代大熊猫仅分布于四川盆地西北缘向青藏高原过渡的山岳地带。

整个区域_______________________本章作者：张亚平，宿兵8 中国动植物的遗传多样性比较狭窄，呈条状弧形，地形复杂，山高谷深，由南向北有凉山、相岭、邛崃山、岷山和秦岭南坡5个山系，属长江水系中游的汉江和上游的嘉陵江、岷江等的支沟河源地带，包括四川、陕西和甘肃3省约40余个县（胡锦矗 1990）。

由于大熊猫单调的食物来源逐渐枯竭，加之自身的生殖力又较为低下，其数量已极为稀少，大约仅存1000只，且多割裂为小群体，处于极度濒危的状态（胡锦矗 1990）。

大熊猫的保护受到国际社会的广泛关注和我国政府的高度重视。

大熊猫的形象还被作为世界野生生物基金会的会徽图案。

我国政府建立了一系列的自然保护区以拯救濒危中的大熊猫，同时，还计划建立一些区域内和区域间的走廊，以促进割裂群体间的基因流，维持群体的遗传多样性。

准确了解大熊猫遗传多样性程度及其群体遗传结构，是探讨大熊猫濒危机制和制定经济有效的保护对策的基础。

迁地保护是大熊猫保护计划中的重要部分。

根据赵庆国等（1993）的资料，在世界上共有35个单位饲养着113只大熊猫。

由于大熊猫的生殖力较低，人工繁殖虽有长足的进展，但仍不理想。

1992年以前，在圈养群体中每年人工繁育的大熊猫数尚不足死亡数的一半，圈养群体只能依靠不断吸纳野生个体来维持其数量。

1992年，人工繁殖获得了巨大成功，有13只幼仔出生，其中11只存活期超过半年。

在人工繁殖过程中，为了最大限度地提高母熊猫受孕的机会，经常采用人工授精和自然交配相结合以及一雌多雄交配的对策。

相应的问题是，由此出生的幼仔具有两个以上可能的父亲。

确定这些未知的父系关系是迁地保护中的重要问题。

鉴于上述原因，近几年来我们实验室在分子水平上较系统地研究了大熊猫的遗传多样性，并建立了“非损伤性”鉴定大熊猫谱系关系的方法。

2．2 同工酶与蛋白质多态性同工酶与蛋白质多态性分析是研究动物核基因组遗传变异、群体杂合度和近交情况的十分有效的方法。

最常用的分析方法是淀粉胶电泳。

其特点是操作相对较为简便，适合于大群体的分析。

只要选择足够数量的座位，就能提供群体遗传结构的基本信息。

我们以成都动物园人工饲养的12只大熊猫的血液作样品，同时以17只亚洲黑熊（Selenarctos thibetanus）作为对照（表2-1）。

我们分析了36种血液同工酶及蛋白质，总计40个遗传座位。

结果表明，在所研究的大熊猫的40个遗传座位中，仅有一个座位（黄嘌呤脱氢XDH-2）存在多态，在此座位存在两个等位基因，分别以A、B表示。

所检测个体中的分布为AA（A2，E8，A12）、AB（A1）、BB （B3，B4，C5，D6，D7，F9，G10，F11）（样品编号见表2-1），无显著的地区间差别，此位点的杂合度（heterozygosity）h＝0.329，其余的39个座位均为单态，即无变异存在，通常用以衡量一个物种蛋白多态水平的两个主要参数——多态座位百分比（percentege of polymorphic lici）P＝0.025和平均杂合度（mean individual heterozygosity）H＝0.008（P值和H值的计算参照Ferrand 1990）。

在同样的实验条件下，亚洲黑熊则存在丰富的多态性，P＝0.216，H＝0.056（表2-2）。

特别值得指出的是6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-PGD）的电泳结果，大熊猫在此座位为单态，而亚洲黑熊则具高度的多态性，显示有3个等位基因，此座位杂合度H＝0.52。

第2章大熊猫的遗传多样性910 中国动植物的遗传多样性近年来，同工酶分析被广泛用于生物多样性的研究。

Smith（1978）等给出已研究过的47种哺乳动物（含200个大陆群体）的H值为0～0.155，而分布区域较为局限的种类H值一般小于0.02。

一些濒危动物如北方象海豹（Mirounga angustirostris）、北极熊（Ursus maritimus）、非洲猎豹（Acinonyx jubatus）等的蛋白电泳研究表明，其蛋白质多态性大大低于同科或同属的近缘种（Bonnel，Selander 1974；Allender，Christianser 1979；O’Brien et al．1983）。

从初步结果可看出，大熊猫在遗传上呈现高度的单态性，而来自云南两个地区的亚洲黑熊则具丰富的地区间和地区内部的多态性，其中滇西（瑞丽）群体内的H＝0.046，滇南（西双版纳）群体内的H＝0.062，两个地理群体间平均杂合度的差异达0.016。

2．3 线粒体DNA序列变异快速进化并呈母系遗传的线粒体DNA是研究动物群体遗传结构及遗传多样性有效的标记（张亚平，施立明 1992）。

线粒体D环区（控制区）由于不编码基因，其DNA序列的进化速度在线粒体基因组中最快，是群体遗传研究中最有效和最灵敏的DNA区域。

从本章2．2中可看出，大熊猫个体间的遗传变异程度很低，因此进化速度最快的D环区是在DNA水平上分析大熊猫个体间和群体间遗传变异的理想选择。

第2章大熊猫的遗传多样性11我们的试验对象为40只大熊猫，其中2只来自马边，1只来自美姑，2只来自越西，11只来自宝兴（8只捕获自野外，其余3只其母亲捕获自野外），1只来自平武，2只来自青川（捕获自野外和其母亲捕获自野外的各1只），1只来自南坪，1只来自白水江。

其余19只是上述大熊猫的后代或与上述大熊猫来自共同的母亲。

用PCR定点扩增线粒体DNA D环区序列。

PCR引物两对：①L15926（5’-TCAAAGCTTACACCAGTCTTGTAAACC-3’）／H16498（5’-CCTGAACTAGGAA CCAGA TG-3’）（Zhang，Ryder 1994）；②根据Zhang和Ryder（1994）D环区序列设计的大熊猫特异的引物，L748（5’-AGACTCAAGGAAGGAGCAAC-3’）／H1142（5’-CGG AGCGAGAAGAGGTACACGTAC-3’),引物名称中的数字表示在该文献DNA序列中的位置。

其扩增片段在第1对引物扩增的区域内。

这对引物主要用于扩增毛发DNA。

PCR扩增条件参照Zhang和Ryder（1994），运行40个循环。

我们采用热变性法直接测定由PCR扩增而来的双链DNA的序列（Zhang，Ryder 1993）。

并用PC／GENE6 . 0版本程序对同源DNA序列进行排序。

在此基础上以PAUP程序作支序分析，确定线粒体DNA单倍型间的亲缘关系。

在我们的40个样品中，我们视每一个来自野外的个体为一个线粒体基因组创立者。

对于人工繁殖的个体，考虑到线粒体DNA的母系遗传特性，我们仅按照它们来自野外的母亲的数量计算创立者。

由此可看出，我们的40个样品包括了21个线粒体基因组创立者，并代表了除秦岭以外的大小凉山、相岭、邛崃、岷山等所有主要山系的大熊猫群体。

这些实验得出DNA 序列变异、单倍型间的分歧时间、群体内和群体间的遗传结构等结果。

2．3．1 DNA序列变异在21个创立者中共检出9种线粒体DNA单倍型。

这9种单倍型318bp的D环区序列的排序见图2-1。

有3个位点出现转换，2个位点出现缺失／插入，未检出颠换。

由此可见，在我们研究的大熊猫序列中，转换发生的频率远高于颠换。

9种单倍型间序列变异的情况见表2-3。

值得注意的是，在熊超科D环区存在一个长达数十至一百余bp的缺失／插入区域（Zhang，Ryder 1993，1994），显然，这是功能上不重要因而变异较大的区域。

而第87位的转换、第135位和第137位的缺失／插入正好位于该区域。

同时，第135位和137位的缺失／插入发生于C n重复序列区，这两位点的变异可能是由于重复序列区在复制过程中的错配所致。

12 中国动植物的遗传多样性虽然在21个创立者中就检出9种线粒体DNA单倍型，即个体间存在变异。