放核酸。
破碎细胞 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA，首先纯化细胞器。
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
DNA酶抑制剂：
1.
金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可
抑制DNA酶活性。如：EDTA
➢ 细胞内的核酸具有复杂的结构，均与蛋白质结合成核蛋白。 ➢ 分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的进化程度而增长。 ➢ DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不同的。
DNA ：主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA （cpDNA），质粒DNA。
RNA：主要存在于细胞质中，如mRNA，rRNA，tRNA，miRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
一、 材料与方法的选择
➢ 核酸存在于各种生物中。临床常见的样品有血液、尿液、唾液、头发、组织及培养细胞等。 ➢ 核酸分离与纯化的方法非常多。如何选择合适的分离与纯化方法是一个首要的问题。因为不同的
水饱和苯酚：由于蛋白与DNA连结键已断裂，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋 白分子溶于酚相，DNA溶于水相。苯酚使蛋白质变性，并抑制了DNase的降解作用。
氯仿：氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，还能去除植物色素和蔗糖。
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外， 异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相、下层有机溶剂相维持稳定。
• 0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。 • 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细
胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 • β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。 注意：Trizol是强腐蚀性物质，小心存放于4℃
OD值范围应该在0.1~0.99之间，否则不符合上述线性关系。
(2) 荧光光度法
• 核酸的荧光染料溴化乙锭(ethidium bromide，EB)嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线 激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。该法灵敏度可达1-5ng，适合低浓 度核酸溶液的定量分析。
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述
1
提取核酸的目的:
核酸分离与纯化的设计与原则
1.实验研究
2.用于研制核酸类药物及保健品 ?
名称 核糖核酸（RNA） 脱氧核糖核酸（DNA） 免疫核糖核酸（iRNA） 转移因子（TF）
主要核酸类药物及用途
治疗范围
口服用于精神迟缓、记忆衰退、动脉硬化性痴呆治疗；静脉注射用于 刺激造血和促进白细胞生成，治疗慢性肝炎、肝硬化初期癌症
在DNA样品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与核酸的污染。
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱRNA的保存
RNA可溶于0.3mol／L的醋酸钠溶液或双蒸水中，在-70 ºC至-80 ºC保存。若以DEPC水溶解RNA 或者在RNA溶液中加入RNA酶阻抑蛋白(RNasin) ，可通过抑制RNA酶对RNA的降解而延长保存时间。
需要注意的是，RNA酶抑制剂或有机溶剂的加入只是一种暂时保存的需要，如果它们对后继的实 验与应用有影响，则应予以去除。
无水乙醇沉淀DNA：与核酸不发生任何化学反应；对盐类沉淀少，沉淀中所含微量乙醇易挥发除去。
2. RNA分离纯化----Trizol一步法
• TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。TRIzol的主要成分是苯酚。 苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质， 但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制 内源和外源RNase（RNA酶）。
2.
阴离子表面活性剂：如SDS。该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白
结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
RNA酶抑制剂：
1.
皂土：带负电荷，能吸附RNase，使其失活。
2.
DEPC(焦碳酸二乙酯 )：通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶
所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需 戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡 是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，再用蒸馏水冲净。
DEPC：焦碳酸二乙酯，是一种强烈但并不彻底的RNA酶抑制剂，通过和RNA酶中His结合使蛋白质变 性，抑制RNA酶活性。
利用乙醇的易挥发性洗掉异丙醇,氯仿； 溶解一些沉淀中可能的有机物杂质
会极大降低RNA的可溶性
(三) 核酸的浓缩
随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物 过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度 会遂渐下降，当不能满足后继研究与应用的需要时， 应对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法。 优点：核酸沉淀后,可以很容易地改变溶解缓冲液和调 整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部 分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。
• 另外，SYBR Gold作为一种新的超灵敏荧光染料，可以从琼脂糖凝胶中检出低于20pg的双链DNA。
2．纯度鉴定
(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法主 要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白 质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260 ／A280比值为1.8 ，纯RNA的A260／A280比 值为2.0。比值升高与降低均表示不纯。
名称 聚肌胞苷酸（聚肌胞）
腺苷三磷酸（ATP） 核酸-氨基酸混合物 辅酶A（CoA） 脱氧核苷酸钠 腺苷一磷酸（AMP） 鸟苷三磷酸（GTP） 辅酶Ⅰ（NDA） 辅酶Ⅱ（NADP）
主要核酸类药物及用途
治疗范围 干扰素诱导物，具有广普抗病毒作用；用化学合成、酶促合成方法生 产 用于心力衰竭、心肌炎、心肌梗死、脑动脉和冠状动脉硬化、急性脊 髓灰质炎、肌肉萎缩、慢性肝炎等 用于气管炎、神经衰弱等 用于动脉硬化，白细胞、血小板减少，肝、肾病 用于放疗、化疗引起的急性白细胞减少症 有周围血管扩张作用、减压作用；用于静脉曲张性溃疡等 用于慢性肝炎、进行性肌肉萎缩等症 用于白细胞减少及冠状动脉硬化 促进体内物质的生物氧化
研究目的对核酸的完整性、产量、纯度和浓度有不同的要求。 ➢ 近年来，试剂盒(Kit)的开发与自动化仪器的使用大大提高了分离与纯化的效率。
选择原则
根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。 无论采取何种方法，都应遵循总的原则： 保证核酸一级结构的完整性， 尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
有抗放射作用，能改善机体虚弱疲劳；与细胞毒药物合用，能提高细 胞毒药物对癌细胞的选择性作用；与红霉素合用，能降低其毒性，提 高抗癌疗效 推动正常RNA分子在基因水平上通过对癌细胞DNA分子进行诱导，或 通过反转录酶系统促使癌细胞发生逆分化，如：可用于肝炎治疗的抗 乙肝iRNA，治疗肺癌的抗肺癌iRNA 相对分子质量较小，含有多核苷酸、多肽化合物，Mr<10000；它只 传递细胞免疫信息，无体液免疫作用，不致促进肿瘤生长，治疗恶性 肿瘤比较安全；亦可用于治疗肝炎等
1．DNA的保存
(二) 核酸的保存
DNA溶于TE缓冲液中在-70 ºC可以储存数年。当TE的pH值为8.0 时，可以减少DNA的脱氨反 应，pH低于7.0 时DNA容易变性。
EDTA作为二价金属离子的整合剂，通过螯合Mg2+、Ca2+等二价金属离子可以抑制DNA酶的 活性。
低温条件有利于减少DNA分子的各种反应，双链DNA因结构上的特点而具有很大的惰性，在 4 ºC条件下可保存较长时间。
冰浴冷却 离心去细胞碎片 上
清液
用水饱和苯酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉
淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥 溶于缓冲液 加入RNase处理除去RNA
苯酚氯仿抽提 沉淀干燥
EDTA：破坏细胞膜，螯合Mg2+、Ca2+，使DNase失活； SDS：可破坏细胞膜、抑制核酸酶，还可使核酸从蛋白质上游离下来； 蛋白酶K：非特异性蛋白酶，可将蛋白质消化成氨基酸； 65℃：高温下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 冰浴：降低温度使蛋白质及多糖杂质沉淀；
(2)荧光光度法：用溴化乙锭等荧光染料示踪 的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于 DNA分子比RNA大许多，电泳迁移率低。通过分 析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果， 可以鉴定DNA制品中有无RNA的干扰，亦可鉴定 在RNA制品中有无DNA的污染。
3．完整性鉴定
凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶 电泳结果可用于判定核酸的完整性。基因组DNA的分 子量很大，在电场中泳动很慢，如果有降解的小分子 DNA片段，电泳图呈拖尾状。完整总RNA除特征性 的三条带外，一般28sRNA的荧光强度约为18sRNA的 2倍，否则提示有RNA降解。若在加样槽附近有条 带，说明有DNA污染。
的活性。
(二) 核酸的分离与纯化
利用核酸与其它物质在一个或多个性质 上的差异设计有效方案，才能使核酸得以分 离。核酸与其它物质的差异包括细胞定位与 组织分布上的差异、物理化学性质上的不同 以及各自独特的生物学特性。
1. DNA分离纯化过程
破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、蛋白酶K) 65℃温育20’