• 凝胶电泳：利用了支持介质形成的网状结构使不同大小的
大分子物质得以分离并在保留于凝胶中，在不同位置形成
条带。
• 电泳迁移率的大小与物质的带电量与分子量的比值（荷质
比）相关。
• 在中性pH或碱性缓冲液中，核酸分子骨架上的磷
酸基团在水中的解离带有负电荷，在电场中由负极 向正极迁移。
• 在均一的凝胶网络中，核酸的迁移速率只与分子的
注意，任何DNA样品或实验试剂均应仔细避免发生污染，
确保实验结果的准确、可靠。
二、PCR反应体系与条件优化
标准的PCR反应体系： 50μl ~100μl体积，包括：模板DNA，底物（dNTP），Taq DNA聚合酶（2.5U），2条引物（各0.25μmol/L），KCl（50
mmol/L），Tris· HCl（10 mmol/L，pH8.4），MgCl2（1.5
• 双链DNA分子在临近沸点的温度下便会分离成两条单链的
DNA分子，当温度降低时，DNA聚合酶以单链DNA为模板并 利用反应混合物中的引物和四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）
合成新生的DNA互补链。
循环1 温度（℃） 94 72 60 60℃ 退 火 （ 1min） 室温下开始 72℃ 延 伸 （ 1.5min）
第三章 核酸的分离与分析
第一节 核酸的分离纯化
一、核酸分离提取的原则与要求 二、核酸提取的主要步骤 三、质粒DNA的分离纯化 四、基因组DNA的制备 五、RNA的提取 六、核酸的定量
一、核酸分离提取的原则要求
• 总的原则：
保证核酸一级结构的完整性， 防止降解，排除其它分 子的污染。
如：防止核酸酶，特别是RNase的污染， 又如：提取DNA分子时，应去除RNA分子，反之亦然。
质粒DNA、RNA以及蛋白质等，
可在离心管内不同位置形成区带。 RNA可与Cs+结合，因此密度最
大，沉积管底，蛋白质漂浮于液
面上。
四、基因组DNA的制备
• 基因组DNA分子量大，受热易变性，复性困难，受剪切力
作用易断裂，因此要采用较温和的条件和方法。如SDS加上 蛋白酶K温和裂解方法。
• 杂蛋白质的去除可用酚/氯仿萃取法。对植物基因组可能需
• PCR引物通常长15~25碱基，其中G＋C约占50%。 • 引物之间不能互配形成双链结构，引物内部也不能形成发夹结构。 • 引物的3’末端必须与目的片段完全相配。 • 引物的5’末端可以不与目的片段互补，可以包含内切酶位点或启动子序
列，但在下一轮反应中，这些序列会被同样合成。
（2）引物Tm
• 加热可以打开双链结构，当一半分子为单链而另外一半分
子仍处于双链状态时的温度称为该双链DNA的熔解温度，
即Tm。由于G· C碱基对间的氢键数较A· T碱基对间的多，故
G· C含量高的DNA的Tm值也较高。
• PCR反应中引物浓度一般为0.1~0.5μmol/L，引物浓度偏高
会引起错配和非特异性产物扩增，同时会增加引物之间形
二聚体的几率。
6. PCR反应条件的选择
3. 分离纯化核酸 关键步骤是去除蛋白质，还要避免核酸的降解。 酚/氯仿抽提法： 酚、氯仿: 两种不同的蛋白质变性剂。氯仿还能加速有机相
与液相分层，去除植物色素和蔗糖。
异戊醇: 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
水相 （ DNA 、 小 分 子 RNA ） 细胞破碎 酚/氯仿 界面（絮状 蛋白质沉淀） 有机相（色 素、脂类、 糖类）
——利用质粒分子量小和闭合环状超螺旋结构性质。
• 分离方法：碱裂解法、煮沸法、去污剂（Triton/SDS）裂解
法、CsCl-EB（氯化铯-溴乙锭）密度梯度平衡离心法、羟基
磷灰石柱层析法等。
1. 碱裂解法：
小量制备DNA较好的方法。
基本原理：在碱性pH（12-12.5）下，DNA分子 均变性，恢复中性时，线性染色体DNA由于两条链 分开且基因组分子量大，单链互相无规则缠绕，不 能准确复性而沉淀；质粒DNA分子因紧密缠绕在一
大小相关，使不同分子量者分开，而相同分子量聚
集形成条带。
一、琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶作为电泳基质有如下优点：①形成的凝
胶具有大量微孔，其孔径尺寸取决于它的浓度，如 0.75%琼脂糖的孔径为800 nm，1%琼脂糖孔径为
150nm；②透明，无紫外吸收；③无毒，热熔冷凝，
制胶方便；④热可逆性，具有一定强度。
循环2
循 环 3…
94℃ 变 性 （ 1min）
时间（
• PCR扩增能力是十分惊人的，理论上讲经过30次的循环反
应，便可使靶DNA得到109倍的扩增，但实际上大约是 106~107倍的扩增。
• 正因为PCR技术具有如此高的扩增敏感性，意味着分子生物
学分析只需要含有痕量DNA的样品，包括一根头发、血迹 等。这对于法医学鉴定具有特别的应用价值。同时，应当
六、核酸的定量
• 核酸定性定量分析是指导核酸分离纯化的重要手段。 • 常见的方法：紫外分光光度法、荧光分光光度法。
紫外分光光度法
• 核酸的最大吸收波长是260nm，吸收波谷在230nm。 • 根据测定，在波长260nm时，1 OD值的光密度相当于双链
DNA浓度为50μg／mL；单链DNA或RNA为40μg／mL；单链
• PCR反应中，dNTP浓度应在20~200μmol/L，高浓度dNTP可
加快反应速度，但同时会增加碱基的错误掺入率和实验成
本；低浓度dNTP虽会导致反应速度下降，但可提高实验的
精确性。4种dNTP在使用时必须以等当量浓度配制，以减 少错配误差。此外，由于dNTP可能与Mg2+结合，因此应注
意二者浓度之间的关系。
要注意的是糖类的除去，可选用十六烷基三甲基溴化铵
（CTAB）选择性沉淀RNA或DNA，也可用四或三甲基溴化铵
（TEAB）加上50%乙醇沉淀多糖。
五、RNA的提取
• 细胞中的rRNA、tRNA和mRNA不容易完全分开，可先制得
细胞核、线粒体、核糖体等细胞器和细胞质，然后再从中
分离某一类RNA。
• mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一、含量少、易降解，
mmol/L），明胶或牛血清白蛋白（BSA）（1μg/ml）。
1. PCR反应模板
• （1）种类：可来自任何生物的单链或双链DNA，也可以是
用化学方法合成的。
• （2）数量：一般而言，PCR检测可以用纳克（ng）级的
DNA克隆模板或微克（μg）级的基因组DNA，或者是拷贝数 为105的目的DNA片段。
块法、冻融法、玻璃奶法、QIAEX法等。
• DEAE纤维素膜插片法简便易行，回收率、纯度都很高，对回收
500bp~5kb左右大小的DNA片段效果很好。电泳洗脱法对大于5kb的
DNA片段较适合。冻融法、SDS溶液浸出法等方法都极为简便，但纯度
与回收率较差。
• 将低熔点琼脂糖挖块与玻璃奶法结合，可回收到质量较好的DNA片段。
寡核苷酸为20μg／mL。可以此来计算核酸样品的浓度，检
测最低限为0.5~1.0μg／mL。
• 通过测定在260nm和280nm的紫外吸收值的比值来估计核
酸的纯度。
DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若A样品的比值高 于1.8，说明其中的RNA尚未除尽，比值小于1.8则说明残留 酚或蛋白质。
辅助因子。反应体系中许多成分都结合Mg2＋，包 括引物、模板、PCR产物和dNTP。通常，Mg2＋的 总浓度必须超过dNTP的总浓度。在一般的PCR反应
中，1.5~2.0 mmol/L Mg2＋是比较合适的（对应
dNTP浓度为200 μmol/L左右）。
3. 底物（脱氧核糖核苷三磷酸，dNTPs）浓度
• 该凝胶孔径小、透明、弹性好、无紫
聚丙烯酰胺 浓度（%）
3.5 5.0 8.0
有效分离范围 （bp）
100~1000 80~500 60~400
外吸收，可用于DNA、蛋白质等的分离。
12.0
20.0
40~200
10~100
三、凝胶电泳分离后核酸片段的回收及纯化
• 方法：电泳洗脱法、DEAE纤维素膜插片法、低熔点琼脂糖凝胶电泳挖
荧光分光光度法
• DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴化
乙锭（EB）嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外 线照射激发下，可以发出红色荧光，其荧光强度与
核酸含量成正比。由此可建立标准曲线，测定未知
样品的浓度。
第二节 核酸的凝胶电泳
• 电泳：是利用带电荷物质的电场中的迁移速率的不同而将
其分离的方法。
分离较为困难。可利用寡聚脱氧胸苷酸（oligo dT)亲和色谱
柱分离。
• RNA的提取要点：
①样品细胞或组织的有效破碎； ②核蛋白复合体变性解离，释放出RNA；
③对R中分离； ⑤多糖含量高的样品还要采取措施有效去除多糖杂质。 最关键的是抑制RNA酶的活性。
起，能准确复性而留于上清溶液中。
2.煮沸法 利用DNA加热变性原理，结合不同DNA复性的差异进 行分离。复性的超螺旋质粒DNA分子以溶解状态存在液相
中，通过高速离心（12,000 × g）可实现分离。
适于快速提取质粒 DNA并进行鉴定，也适用于大量提 取，对纯度要求高的，可做进一步纯化处理。
3. CsCl-EB密度梯度平衡离心 CsCl是一种大分子量的重金属 盐，长时间超速离心时，在管中 形成1～1.8052g/cm3自上而下 增加的密度梯度。染色体DNA、
二、核酸提取的主要步骤
1. 样品准备 2. 细胞破碎 3. 分离纯化核酸
4.核酸的沉淀浓缩
1. 样品准备 新鲜动植物组织材料：清洗、去掉杂质。少量样品可用液 氮冻结，然后快速碾磨成粉未状。
动物细胞：胰酶消化，离心沉淀，PBS液漂洗，收集沉淀