分子实验室、细胞实验室常用配方————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期:ﻩ(一)WB相关试剂及常用缓冲液●RIＰA（１０0mI）(最后要调pH为７.4）终浓度分子量称取50mM 1２1.14 60５．7mg Ｔｒｉs-HCI（pH７.4)NaCI １50 ｍＭ５8.4４87６.６ｍgTritｏnＸ-1０0 1% 1mI脱氧胆酸钠1％１gEDTA １mM 292.24８２９.224８mｇSＤS 0．1％０.1gＰMSF（１00ｍM) 使用时每1ｍl加１０ｕl●10%过硫酸铵溶液AP（分装保存于-20度)AP粉末 1ｇddＨ2０ 10mｌ●1０%SDS(十二烷基硫酸钠）：SＤＳ粉末１0gｄdH20定容到 100ml注意：用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡●6X蛋白质sample bufferTris-HCl(１M,ｐH6.８) 30ｍLＳＤＳ10ｇ甘油 30ｍLDTT（1５4.２5）９.3g溴酚蓝０．０6gdd H2０定容至10０mＬ●10XPBＳ缓冲液的配制：ＮaCｌ 80gKCl 2gＮa2ＨPＯ4 14．4ｇ(十二水合36g）KH２PO40 2.４g加800 mLddH2O,根据开始的pH用ＮaOH或ＨCL调pH到７.4,调好pH再定容到1升。
配好后用高压蒸气灭菌后常温保存最好是在4度●PBSＴ(1X)ＰBS(1X） 500mlTweeｎ 2０５０0μｌ●5０×Tris－乙酸（TＡE）缓冲液配制1Ｌ溶液各成分的用量Ｔris粉末 2４2ｇ冰醋酸 57.１ｍlNａ2EDTA·2H2O 3７.２gddH20定容到 1Ｌ●封闭液脱脂奶粉 5g叠氮钠 0．02g(现配现用时可不加)PBS 定容到1０0mL●染色液(室温)１L 500ml 200ml 100ｍl甲醇5０0ｍＬ25０100 50乙酸１０0 mL 5０20 10R2５0考马斯亮蓝0.5g 0.2５g ０.1 g ０．05 gH2０4０0 mL 20０8０40●脱色液：(室温)甲醇 165mＬ乙酸５0 ｍLH２０785 mＬ●8.8Buffer:（调ｐH至8．８，4度保存)1０0ml 200ｍlTris 18．17ｇ3６.３4g1０％SDS 4mＬ８mlddH２０定容至100mL 200ml● 6.８ Bufｆｅr: (调pH至６.8,４度保存)10０ｍl 200ｍlTris 6．０6g 12.１2g10％SDS 4mL 8mlｄdH20 定容至１00mＬ20０ml●转移缓冲液(1０×trａns bufｆeｒ）:（常温保存）1L ２L甘氨酸1４4g 288ｇTrｉs粉末30．3ｇ60.6ｄdＨ20 定容至１L 定容至2L使用时甲醇 200mＬ转移缓冲液（１0×）１０0 mＬｄdＨ２0 700 mL●电泳缓冲液(1０×）（ｒunｎing bｕffeｒ）:(常温保存）１L ２L甘氨酸144g 28８gTris粉末30.3g 60.6SDS 10g 2０gddH20 定容至1L 定容至2L●10Х)ＴＢS: （常温保存)NａCl 80.0ｇTｒis粉末 24．2gddH20 定容至１L●ＴBＳT(１Ｘ)TＢS(1X) 5０0ｍｌTweeｎ２0 ５0０μl●Stｒippiｎg ｂuffer(可反复利用)温老师组配方10％SDS 10ｍlΒ-巯基乙醇35０ lTriｓ－ＨCI（pH６.８） 6.２5mｌ（６.0６加到50mL水)加入ddＨ２Ｏ至5０mL●Stｒiｐping buffer（可反复利用)郭老师给配方甘氨酸15gＳDＳ1ｇTｗeeｎ20 １mlｄd ddH2O 1L作这个buffer洗20min，然后用PBST洗3次，再重新封闭孵抗体。
(二)细胞和细菌培养基、抗生素●LB培养基(当天灭菌后放4度存放)100０ml 500mｌ３０0 mｌ2５0 ｍl 200 ml 氯化钠10g 5ｇ３g 2．5g 2g蛋白胨10ｇ5g ３g ２．5g 2g酵母提取物5g 2.5g 1.5ｇ 1.25ｇ1gdｄH20 定容至１000ｍl 定容至500ml 定容至３0０mｌ定容至２50ｍl定容至２00ml●LB平板：(当天灭菌后倒平板,放4度存放）1000ｍl 50０ml ３０0 ml 250 ml ２00 ｍl 氯化钠10g 5g 3g ２．5g 2g蛋白胨１０ｇ5ｇ3ｇ 2.5g 2g酵母提取物5g 2．5g 1.5g 1.25g １g琼脂1５g 7．５ｇ４.５g 3．725g 3gddＨ2０定容至1000mｌ定容至500ml 定容至300ｍl定容至２50ml定容至2０0ｍl●ＳＯB培养基将下列组分溶解在0.９Ｌ水中：ﻫ蛋白胨2０gﻫ酵母提取物 5gﻫ氯化钠 0.5g1mol／L氯化钾 2．5ｍl用水补足体积到1L。
分成１00ml的小份,高压灭菌。
培养基冷却到室温后,再在每100ml的小份中加1mｌ灭过菌的1moｌ/Ｌ氯化镁●1M IＰTＧ（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量为２３8．3）)溶液ＩＰTG粉末2．383gdｄH20 定容到10ｍl用0．22μm滤器过滤除菌,分装成1ｍl小份贮存于-20℃。
●Amｐ+（50mg/ml)Amp+粉末50ｍｇddＨ20 1ml注意：分装保存于－２０度,使用时按10０0:1的比例用●Kana＋（５0mｇ/ml)Kana +粉末 50mgddH２0 １mｌ注意:分装保存于-20度，使用时按１000:１的比例用●胰酶:抽滤,长期保存可放负20度粉末 0．25gEDＴＡ0.02-0.03g１XPＢS 100ｍl●高糖DＭＥM培养基:抽滤保存在4度粉末全部碳酸氢钠３.7gddH２0 定容到1Ｌ（用盐酸调pH值到：7.２-7．4)●Ｇ418母液(１00ｍg/ml）用０.22μM滤菌，分装存于-20度粉末 1gPＢS １0ml●zeocin母液（100mｇ/ml）用０.22μＭ滤菌,分装存于-２０度粉末1gｄｄH２Ｏ１0ｍl●Blaｓticidiｎ(１００mg／ml）用0.22μＭ滤菌,分装存于－２0度粉末０．3gPBS 1０ml(三）利用His－tag从细菌中纯化蛋白配方透析液配方终浓度母液浓度量取体积２0mM １Ｍ20ml Ｔrｉs-ＨＣl(pＨ:8．0)NaＣl 20mM 4Ｍ 5 mlMｇCl22mＭ１M 2 ｍｌＤTT 1mM１M １ｍl甘油50% 500ｍlddHO472 ml2●超声裂解液(ｌyｓｉｓbuffｅr):2011年做蛋白纯化时用Nａ3PＯ4(１64） 8.2ｇ(５0ｍM)NａCl （58.5）１7.55ｇ(30０mM)加8０0 mL dｄH2O溶解，用2M NaOH或者２ＭHCL 调pＨ到8.0,再定容到1升。
配好后用高压蒸气灭菌后常温保存。
●洗涤液(wａsh buffer):20１1年做蛋白纯化时用Na3PO４８.２g(5０mM)ＮａCl １7.55g(300mM）咪唑 0．６８１ｇ（1０mＭ)加8０0 mLdｄＨ2O溶解,根据开始的pＨ用2M NａＯH或者２M HCL调pH到８.0,调好pH 再定容到1升●洗脱液（elutiｏn bufｆer)：2０１１年做蛋白纯化时用Ｎａ3PO4 ８.2ｇ(5０mM)ＮaＣl 1７.5５g（３０0mM）咪唑1７.02５g(25０mＭ)加80０ｍLdｄH2O溶解，根据开始的pH用2ＭNaOH或者2ＭHCL调ｐH到8．0,调好pH再定容到１升)PrepEase®Ｈistｉｄｉｎe-Taggeｄ PｒoｔeiｎＰｕｒificaｔion Kits - Hｉgh Spｅci ficiｔy●８Ｘ LEＷ Bｕffｅr (Lyｓis-Equiｌiｂrｉｕｍ-Waｓｈ Buffer）：（室温保存）pH:８.０NaH2PＯ４.2H2O 6.240４g(4０0mM）NaCl 14.0２56ｇ(2．4M）dＨ2０定容到100 ｍL (调节ｐＨ：8．0）●4X Eｌutiｏn Ｂｕfｆer:(室温保存)ｐＨ:８.0NaH2PＯ4．2H２Ｏ 3.1202 g（２00ｍM)NａC l7.0128g（１.2M）咪唑６．81 g(1M）dH２０定容到100 mL(调节pH:8.0）●ＥＤＴA:（1０0mM)EDTA 2.92３ gdH２0 定容到100 mL●NiSO4:NiSO4 .6H2Ｏ２.6２8５g(１00mＭ）ｄH20 定容到100 mL●溶菌酶：（使用时1ml溶液加入2０uｌ)粉末 50ｍｇdｄH20 1ｍL(四)利用His-ｔag从细胞中富集蛋白配方●磷酸钠缓冲液按图示比例混合0．2 M Nａ2HＰO４溶液和０.2 MNaＨ２PO４溶液,得到两种缓冲液，pＨ分别调节成为8.0和６．3.pH ０.2 M Na2ＨPO4体积/mL 0.2 MNaH2PO4体积/mＬ6.3 11.２5 38.75８.0 47.35 2.65●细胞裂解液（最好新鲜配制,当天使用)Cｅllｌysis ｂuffer终浓度配１０mｌ配１5ml 配20ml 配40ml 配30ml盐酸胍（g) 6M 5．7318 8.5977 １1.46３６2２．927２17．１９５4Tｒis(ｇ) 10 mM ０．01２1140.0181７1 0.024228 0.048４56 0.036３42ｐH 8.0ｂuffer(mｌ) 100 mＭ 5 ７.5 10 20 15 (注意胍盐是有害试剂注意这里用的磷酸钠缓冲液pＨ必须8.0!）(注意二价阳离子螯合剂，还原剂,会导致镍从树脂上的洗脱)本实验的所有试剂中EDTA浓度不得超过1 mM,DTT浓度不超过5 ｍM，巯基乙醇浓度不超过20 mM。
●pＨ8.0的洗脱溶液（最好新鲜配制，当天使用）pH 8.0的wasｈbuffer 终浓度配1０0ｍl 配５0ｍｌ配20ml 配4０ml 配30mlUreａ尿素(g）8Ｍ48.04８24．02４9.6０96 1９.21９２1４.4144Ｔrｉs(g) 10 mM 0.１2114 0．06０57 0.０２42280.048456 0.036３42ｐＨ8.０Na３PO4buｆfer(ml)100 mM 50 25 10 20 15Ｔrｉton X-10０(ul) ０.１%(ｖol/vol)100 50 ２０40 3０b-mercａｐtoeｔhanol．巯基乙醇(ul)5 mM ３5 17．５７14 10．５●ｐＨ 6.3 ｗash buffｅr (现配现用)pH6．3的wａsｈｂuffer 终浓度100ml 配50ml 配30ｍl pＨ６.3的ｗasｈbｕｆｆｅrＵrea尿素(g）8Ｍ４8.048 ２４.024 １4．４144Urea尿素(g)Tris(g) 10 mM ０.12１１4 ０．06０570.036342 Ｔｒis(g）pH6．３Nａ３ＰO４ｂuffer(ml）100mM50 2５1５pH6.3Nａ3ＰO４buffeｒ(ml)TritｏｎX-100(ul）0.1％(vol/voｌ)１00 50 ３0 Triｔｏn X-10０（uｌ)注意使用pＨ为6.３的磷酸缓冲液,而且pH不得低于6,pH要精确配制,非常重要！Histｉｄine 的质子化，会导致镍树脂上的解离,所以要精确测定pＨ,并且以ｐH试纸校对，而不是仅仅依靠pH仪器。