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重组蛋白药物质控要点

原液：等电点检测

不同蛋白质由于某些带电氨基酸带负电荷的Glu，Asp和带正电荷 的Lys，Arg,His等的存在，其净电荷各不相同，即等电点各不相同 。均一的蛋白质只有一个等电点，有时因加工修饰等影响可出现 多个等电点，但应有一定的范围。所以等电点测定是控制重组产 品生产工艺稳定性的重要指标。
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重组蛋白药物质控要点

原液：肽图检测


肽图分析是DNA产品质控的重要手段之一。通过肽图分析，可从 一级结构研究重组产品与天然品的同质性。重组产品与天然产品 具有相同的指纹图谱，它们具有相同的一级结构。进一步验证了 它们的同质性。 大多基因工程产品都将肽图分析作为控制其一致性的重要常规指 标之一，而采用的方法中．又以HPLC肽图分析最为多见。肽图谱 对每一种蛋白质来说是特征和专一的。因此可用于检查各批产品 蛋白质一级结构的一致性在肤图分析中的应用基因重组药物的肽 图分析是评价基因重组制品和天然蛋白质的同一性以及不同批制 品间同一性的重要手段，也是证明细胞遗传稳定性的有效手段之 一。
文件编号： T09-SS10 生效日期： 年 版本号：01
月
日
重组蛋白药物一般生产工艺与质 量控制要点
起草人/日期： . 审核人/日期： .
批准人/日期：
.
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培训目的及范围
培训目的 1、熟悉生物制品一般生产工艺及质量控制要点。 2、了解检验项目设置缘由及控制标准。 培训范围 1、QC部 2、QA部
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重组蛋白药物质控要点

菌种：一般检测项目
中间体名称 质量标准 检测项目 划种LB平板 染色镜检 对抗生素抗性 电镜检查 菌种 生化反应 表达量 质粒检查 目的基因核苷酸序列检查 质粒稳定性 质粒检查 合格标准 应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长 应为典型的革兰阴性杆菌 应与原始菌种相符 应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染 应符合大肠杆菌生物学性状 在摇床中培养，应不低于原始菌种表达量 质粒酶切图谱应与原始重组质粒相符 符合规定 符合规定 质粒酶切图谱应与原始重组质粒相符
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重组蛋白药物质控要点

发酵液：一般检测项目
现质量标准
中间体名称 检测项目 表达量 质粒丢失率检查 合格标准 ≥25% 符合规定
发酵菌体
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重组蛋白药物质控要点

原液：一般检测项目
1 生物学活性（有效项目） 2 蛋白含量（有效项目）
3
5 7 9 11 12
比活测定（有效项目）
分子量（鉴别项目） 肽图（鉴别项目） N-末端氨基酸序列测定（鉴别项目） 宿主菌蛋白残留量（安全项目） 细菌内毒素（安全项目）
第二步：菌体发酵与诱导表达
第三步：目标蛋白提取与纯化 第四步：配液与冻干
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重组蛋白药物一般生产工艺

第一步：工程菌构
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重组蛋白药物一般生产工艺

目标产物鉴定

基因序列测定 表达产物结构确证 特异性鉴别实验 N末端氨基酸序列分析 氨基酸组成分析 C末端氨基酸序列分析 激光解析飞行时间质谱分析 X射线晶体衍射分析
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基本知识
蛋白质的基本性质
1、蛋白质大小（一般5-10nm） 2、蛋白质形状 3、蛋白质核电性 4、蛋白质等电点（一般4.0-10.0） 5、蛋白质疏水性
6、蛋白质溶解度
7、蛋白质密度（一般1.3-1.4g/cm3） 8、蛋白质与配体结合能力（酶，抗体） 9、蛋白质与金属螯合能力（CU2+、ZN2+、CA2+、NI2+） 10、蛋白质其它特殊性质(抗热性、抗蛋白酶)
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培训内容
第一部分：重组蛋白药物一般生产工艺 第二部分：重组蛋白药物质控要点 第三部分： 注射用重组人胸腺肽α1与注射用重组白 介素-2（125SER）生产工艺 第四部分：注射用重组人胸腺肽α1与注射用重组人白 介素-2(125SER)质量控制标准
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第一部分：重组蛋白药物一般生产工艺
第一步：工程菌构建
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重组蛋白药物质控要点

原液：紫外光谱扫描检测

这是基因工程药物的一个重要物理常数，对于一个蛋白质来说， 它的最大吸收波长是固定的。对某一重组蛋白质来说，其最大吸 收波长是固定的；在生产过程中每批产品的紫外吸收光谱应当是 一致的。测定时以生理盐水为对照，在200～350 nm范围内对待 检样品溶液进行扫描，每批制品紫外吸收图谱应与对照品一致且 在280nm附近最大吸收波长应与理论值相符。
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重组蛋白药物质控要点

原液：圆二色谱分析


对R和L两种圆偏振光吸收程度不同的现象，这种吸收程度的不同 与波长的关系称圆二色谱，是测定分子不对称结构的光谱法。 用于测定蛋白质的立体结构，核酸和多糖的立体结构。 在蛋白质分子中，肽链可形成α-螺旋、β-折叠、β-转角等特定的 立体结构。这些立体结构都是不对称的。
金属亲和层析
免疫亲和层析 层析聚焦 凝胶过滤层析
金属螯合能力
特异抗原位点 等电点 大小、形状
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重组蛋白药物一般生产工艺

蛋白纯化原理

亲和层析 离子交换层析 疏水层析 凝胶过滤层析 反相层析
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重组蛋白药物一般生产工艺

带组氨酸标签的亲和层析 组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团， 这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电 引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就 是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作 用。组氨酸标签是原核表达载体上6-14个组氨酸的区段,这个标签 在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本 上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化

冻干过程 预冻干 一次升华 二次升华
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重组蛋白药物一般生产工艺

典型冻干曲线
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第二部分：重组蛋白药物质控要点
原辅料、包材、菌种 发酵液、原液 半成品、成品
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重组蛋白药物质控要点



原辅料-符合药典和生物制品主要原辅料质控标准等-略 包材-符国家药品包装容器（材料）标准-略 菌种-符合药典或注册要求 发酵液-符合药典或注册要求 原液-符合药典或注册要求 半成品-符合药典或注册要求 成品-符合药典或注册要求
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重组蛋白药物质控要点

原液：分子量检测

分子量是蛋白质理化性质之一。一般采用还原型SDS-PAGE法测定 ，蛋白质在SDS和B-巯基乙醇存在下沸水浴5min，形成表面带大 量负电荷的杆状分子，降低了分子形态和电荷的影响，在电泳过 程中蛋白迁移率基本只与其分子量相关，目前广泛用于蛋白分子 量的测定。该法具有简便，快速，直观等特点，目前作为基因工 程药物原液检定的常规方法。该法可将蛋白质按分子量大小进行 分离，因此，可用于蛋白质纯度分析，同时还能对聚合体进行分 析。

第三步：目标蛋白分离与破碎
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重组蛋白药物一般生产工艺

第三步：目标蛋白分离与破碎
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重组蛋白药物一般生产工艺

第三步：目标蛋 白纯化
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重组蛋白药物一般生产工艺

第三步：目标蛋白纯化（反相与超滤）
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重组蛋白药物一般生产工艺

蛋白纯化方法
分离方法
沉淀法 硫酸铵 丙酮 溶解度 溶解度
蛋白质性质基础
4
6 8 10 12
纯度测定（有效项目）
紫外吸收光谱（鉴别项目） 等电点（鉴别项目） 外源性DNA含量（安全项目） 圆二色谱分析（鉴别项目）
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重组蛋白药物质控要点

原液：生物学活性检测

生物学活性测定是保证基因工程药物产品有效性的重要手段。参 照中国药典标准中的规定及注册质量研究资料，采用脱E受体法或 MTT比色法检出本品，专属性强、方法可靠。


宿主细胞DNA只作为一种细胞污染因素而不作为一种危险因素。 目前均采用DNA杂交实验，用固相斑点杂交法，以地高辛标记检 测试剂盒或者用同位素标记DNA探针进行测定，必须提供相应宿 主细胞DNA标准品。由于设备和消耗试剂昂贵，一定程度限制了 该方法的普及。 由于基因工程药物的生产过程中所使用的各种表达系统中都含有 大量的DNA。因此世界各国的药品管理机构都对基因工程药物中 所允许的DNA残余量严加限定。WHO和FDA将此限量定在100pg ／剂量。参照药典三部附录IX B外源性DNA残留量测定法每1次人 用剂量应不高于10ng。
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重组蛋白药物质控要点

原液： N-末端氨基酸序列测定

可以确证表达产物的编码准确性。对蛋白质的全氨基酸序列分析 ，难度大，耗时长，从统计学观点只要测定N-末端15个氨基酸便 可保证其顺序的正确性。故N-末端15个氨基酸序列分析可作为重 组蛋白质的重要鉴别指标。
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重组蛋白药物质控要点

原液：外源性DNA含量检测
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重组蛋白药物质控要点

原液：圆二色谱检测

蛋白质的肽键在紫外185～240纳米处有光吸收，因此它在这一波 长范围内有圆二色性。几种不同的蛋白质立体结构所表现的椭圆 值波长的变化曲线──圆二色谱是不同的。α-螺旋的谱是双负峰 形的，β-折叠是单负峰形的，无规卷曲在波长很短的地方出单峰 。蛋白质的圆二色谱是它们所含各种立体结构组分的圆二色谱的 代数加和曲线。因此用这一波长范围的圆二色谱可研究蛋白质中 各种立体结构的含量。蛋白质含酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸,它们 在240～350纳米处有光吸收,当它们处于分子不对称环境中时也表 现出圆二色性。这一范围的圆二色性反映出在蛋白质分子中上述 氨基酸残基环境的性质。