植物色素的提取学院：专业：姓名：学号：2012年7月6日植物色素的提取摘要在用抽滤法提取色素的过程中，由于抽滤时不好控制，非极性溶剂难免会被抽去，且在几次转移中损失较多，程序繁杂．用浸泡法操作简便易行，损失少，产率高。

故在实验中采取了浸泡法提取色素，使用薄层色谱、柱色谱对叶绿素、胡萝卜素和叶黄素进行了分离。

薄层层析时使用了石油醚-乙酸乙酯=8:2、6:4、5:5、4:6，对比展开效果。

在柱层析时，用洗脱剂分离得到不同物质，结果证明石油醚-乙酸乙酯=8:2做洗脱剂分离胡萝卜素效果最好。

将得到的胡萝卜素进行紫外光谱测定，检验实验成果。

薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。

一、引言绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。

叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg))，差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。

它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂，也是食用的绿色色素，可用于糕点、饮料水等中，添加于胶姆糖中还可消除口臭。

植物中a的含量通常是b的3倍。

尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于石油醚等一些非极性溶剂。

胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。

它有三种异构体α—，β—,和γ—胡萝卜素，其中β—异构体含量最多，也最重要。

生长期较长的绿色植物中，异构体中β—的含量多达90％。

β—具有维生素A的生理活性，其结构是两分子维生素A在链端失去两分子水结合而成。

生物体内，β—体受酶催化氧化即形成维生素A。

目前，β—体可作为维生素A 使用，也可作为食品工业的色素，β一胡萝卜素还有防癌功能。

叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，在光合作用中能起收集光能的作用。

在绿叶中通常是胡萝卜素的两倍。

较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。

由此可见，叶绿素等天然色素有广泛的用途，对于色素的提取与分离就显得很重要了．本实验就提取和分离做了相关的研究。

二、实验部分2.1实验目的1.掌握薄层色谱法和柱谱法分离色素的原理和基本操作。

2.掌握减压蒸馏、色谱板的制备等基本操作2.2实验原理薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。

一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。

吸附是表面的一个重要性质。

任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。

在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。

例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。

当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。

由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。

如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的Rf值（后面介绍Rf值）对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法加以定量。

柱色谱法的简介柱色谱法又称柱层析。

固定相装于柱内，流动相为液体，样品沿竖直方向由上而下移动而达到分离的色谱法。

它既区别于用于分离分析的GC和HPLC法，也区别于样品在平面形固定相内移动的纸层析和薄层色谱法。

本法主要用于分离，有时也起到浓缩富集作用。

在环境分析测试中，本法广泛用于样品的前处理，如在水和气溶胶的有机污染分析中，将萃取液转移到层析柱内，而后用环己烷洗脱烷烃部分，用苯洗脱多环芳烃类污染物，用乙醇洗脱极性组分；在土壤分析中，用氧化铝柱捕集分离稀土元素钍、铊等。

吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。

当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。

当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。

柱色谱法column chromatography 将色谱填料装填在色谱柱管内作固定相的色谱方法。

根据色谱柱的尺寸、结构和制作方法的不同，又可分为填充柱色谱和毛细管柱色谱。

本实验成败的关键是：装柱要紧密，要求无断层、无缝隙；在装柱、洗脱过程中，始终保持有溶剂覆盖吸附剂；一个色带与另一色带的洗脱液的接受不要交叉。

2.3仪器和药品玻璃片（10cm×3cm）,展缸，毛细管，分液漏斗，锥形瓶，底烧瓶，玻璃棒，色谱柱，分液漏斗，烧杯，量筒，减压抽滤机，UV-240紫外分光光度计新鲜菠菜，硅胶G，羧甲基纤维素钠，乙醇，石油醚，乙酸乙酯，无水硫酸钠圆2.4实验步骤和实验现象1.薄层色谱板的制备（1）制备薄层载片如是新的玻璃板（厚约2.5mm），切割成150*30*2.5mm或100*30*2.5mm的载玻片，水洗，干燥。

如果重新使用的载玻片，要用洗衣粉和水系，用水淋洗，用50%甲醇溶液淋洗，让片完全干燥。

取用时应让手指接触片的边缘，因为指印沾污片的表面上将使吸附剂难于铺在片上。

（2）制备浆料容器：带螺旋盖的广口瓶。

操作：制成浆料的要求要均匀，不带团块，粘稠适当。

为此，应将吸附剂慢慢地加至溶剂中，边加边搅拌。

如果将溶剂加至吸附剂中常常会出现团快状，加料毕，剧烈搅拌，保证充分混合。

量取30ml 0.5%的羧甲基纤维素钠，和水混合后用加热装置加热至70℃，溶解后抽滤，吸取10ml滤液加入4g硅胶G，充分混合后研磨。

铺制薄层板操作是：在带有螺旋盖的瓶子中盛满浆料（1g硅胶G需要3ml 氯仿或需要3ml氯仿-乙醇混合物（体积比为2：1），在不断搅拌下慢慢蒋硅胶加入于氯仿中，盖紧，用力振摇。

使之成均匀糊状），选取大小一致的载玻片紧贴在一起，两块同时浸涂。

因为浆料在放置时会沉积，故浸涂之前均应将其剧烈振摇。

用拇指和食指捏住玻璃片上端缓慢地均匀地将片浸入浆料中并取出多余的浆料任其自动滴下，直至大部分溶剂已挥发后将两块分开，放在水平板上晾干。

若浆料太稠，涂层可能太厚，甚至不均匀，若浆料稀薄，则可能是涂层薄。

若出现上述两种情况，须调整粘稠度。

要掌握铺层技术，反复实践是必要的。

薄层板的活化温度，硅胶板于105—110℃烘30min，氧化铝板于150—160℃烘4h，可得活性级的薄层，活化后的薄层板放在干燥器内保存备用。

2.色素溶液的制备称取10g洗净后用滤纸吸干的树叶，用剪刀剪碎并与10ml乙醇拌匀，在研体中研磨，一次用乙醇：石油醚=2:3混合液10ml提取两次。

将合并的提取液放到50ml分液漏斗中，用10ml*2水洗，弃去水层，石油醚层用少量无水Na2SO4干燥（约15min），然后将石油醚层转移到带支管的试管内，用水浴加热，水泵减压，浓缩到约0.5ml。

3.展开剂的配置用石油醚和乙酸乙酯按不同的体积比混合，得到不同极性的展开剂：石油醚：乙酸乙酯=8：2、6：4、5：5、4：64.分离在硅胶板上点样后，分别用不同展开剂展开，分别测出胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素的Rf值，比较不同展开剂系统的展开效果。

点样在距薄层长端1cm处，划一条线，作为起点线。

用毛细管（内经小于1mm）吸取样品溶液垂直地轻轻接触到爆曾的起点线之上。

如果溶液太稀，一次点样不够，第一次点样干后，再点第二次、第三次….每次点样都应在同一圆心上。

点的次数依照样品溶液浓度而定，一般为2-5次。

若样品太少时，有的成分不易显出；若样品量太多造成斑点过大，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离。

点样后的斑点直径以扩散成1-2mm圆点为度。

若为多出点样时，则点样间距为1-1.5cm.展开薄层的展开须在密闭的容器中进行。

先将选择的展开剂放在带有塞子的广口瓶中，再将点样好试样的薄层板放入广口瓶中进行展开。

点样的位置必须在展开剂的液面之上。

当展开剂上升到薄层的前沿（离顶端1cm处）或各组分已明显分开时，取出薄层板放平晾干，用铅笔或小针划前沿的位置后即可c测量长度计算Rf值。

5.柱色谱分离量取40ml硅胶和100ml石油醚:乙酸乙酯=8:2混合均匀，倒入色谱柱中，开启色谱柱下面的塞子，并不断从色谱柱的上方加入展开剂是色谱柱的观众总保持接近满的状态。

当硅胶的高度不断下降时，留下约1-2cm的石油醚，然后关闭色谱柱。

静置后，从色谱柱上方加入样品，注意要用胶头滴管沿着色谱柱内壁旋转着慢慢滴下去，避免使硅胶表面变得不水平。

边加入样品，边开启色谱柱。

当样品加入完毕后，再将石油醚和乙酸乙酯按8：2体积比混合的液体从上层加入冲洗硅胶，把胡萝卜素冲洗下来。

用干燥的容器收集，测量体积。

三、实验结果和讨论1.实验原始数据8:2 6:4 5:5 4:6V石油醚：V乙酸乙酯0.919 0.926 0.937 1.000胡萝卜素的Rf值叶绿素的Rf0.452 0.842 0.851 0.967值0.274 0.526 0.738 0.800叶黄素的Rf值样品吸光度:0.577样品体积：16ml样品浓度：5.12×10-6胡萝卜素质量：8.19×10-5g2.讨论本实验根据的是四种色素在石油醚中的析出速度不同来分离的。

析出的速度为胡萝卜素>叶绿素>叶黄素。

根据各种色素的Rf值的变化总体趋势，在石油醚：乙酸乙酯=8:2时，能很好地分出胡萝卜素；在石油醚：乙酸乙酯6：4，5：5，4：6时分离顺序为胡萝卜素、叶绿素、叶黄素。

这说明胡萝卜素极性弱，叶绿素，叶黄素极性逐渐增强。

这次试验中虽然用的菠菜很多，但提取的色素很少，主要的原因可能是用的菠菜中含有的胡萝卜素比较少，还有就是操作中不谨慎损失的。

四、实验心得通过这次试验我收获很多，不仅学会了柱层色谱的分离方法，更加锻炼了我的操作能力。

这次试验总体来说还算比较成功，虽然测得的Rf值的趋势于是是有点偏差，而且胡萝卜素的产量比较少，但是总体来说没有大的失误。

对实验要保证严肃、认真、科学、严谨的态度，这也是我们这次试验基本上成功的保证。

认真的做好每一步对实验的结果都是很重要的。

从这次的实验中，我们不仅要对实验保证这样的态度，对别的事情也要有这种态度。

五、参考文献[1] 杨革，李亚．类胡萝卜素发酵生产条件的研究．食品科学，1998，(8)：20．[2] 裴凌鹏,惠伯棣,金宗濂,等.黄酮类化合物的生理活性及其制备技术研究进展.食品科学,2004,(2):203-207.[3] 王立,姚惠源,陶冠军等.乌饭树树叶中黄酮类色素的抗氧化活性.食品与生物技术学报，2006，2（54）：81-88.[4] 郭凤华，王慧. 天然色素的提取和应用研究. 山东食品发酵2008.(1) :27-30[5] 姜文候，单志萍等，β-胡萝卜素的应用、市场和天然型产品的发酵法生产，食品与发酵工业，1994.3，P65～61[6] 张建华，胡萝卜素中β—胡萝卜素测定方法，内蒙古农业大学学报，2000.3[7] 张茂玉等，蔬莱中胡萝卜素的测定纸层析法，营养学报，1984.2，P177[8] 吴衷。