Advances in Microbiology 微生物前沿, 2015, 4, 27-35Published Online June 2015 in Hans. /journal/amb/10.12677/amb.2015.42005Advances in Marine Sediments of the TotalDNA Extraction MethodXinqiang Zhao, Xiaopeng Yu, Mingai Zhang, Cuifang Yu, Fansheng Cheng*College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao ShandongEmail: 1760029992@, *fscheng@Received: May 25th, 2015; accepted: Jun. 16th, 2015; published: Jun. 19th, 2015Copyright © 2015 by authors and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY)./licenses/by/4.0/AbstractMicroorganisms inhabited in marine sediments server as an important role in the marine ecosys-tem as well as the biosphere substances’ circulation. The gradually deepening understanding of the biodiversity and the continuous improvement of research methods in marine sediments still face some basic obstacles, such as the cultivation of microorganisms and DNA extraction. This pa-per aims to summarize the current research progress in environmental DNA extraction method in marine sediment, which corresponds to Metagenomics and other modern molecular ecology re-search methods. Key steps in the sampling, transportation, storage, samples pretreatment, cell disruption, total DNA enrichment, storage and quality evaluation were discussed in detail.KeywordsMarine Sediments, Microbial Diversity, DNA Extraction, Research Progress海洋沉积物总DNA提取方法研究进展赵新强，于晓朋，张名爱，于翠芳，程凡升*青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛Email: 1760029992@, *fscheng@收稿日期：2015年5月25日；录用日期：2015年6月16日；发布日期：2015年6月19日*通讯作者。

海洋沉积物总DNA提取方法研究进展摘要海洋沉积物中微生物是海洋生态系统的重要组成部分，在维持生态平衡方面发挥着重要作用。

随着人们对生物多样性重要性认识的不断深入及研究方法的不断改进，对海洋沉积物中微生物的研究取得了新的进展，但仍然存在一些问题，如微生物难培养、DNA难提取等。

本论对海洋沉积物微生物多样性研究中的关键步骤进行分析探讨，主要包括样品取样及预处理、细胞的裂解、总DNA的提取、纯化和保存方法及质量评价等方面。

阐述国内外对海洋沉积物微生物多样性研究中DNA提取方法取得的成果，以及存在的局限性。

关键词海洋沉积物，微生物多样性，DNA提取，研究进展1. 引言海洋沉积物中的微生物是自然界生态系统中的重要组成成员，在维持环境与海洋生态平衡方面发挥着至关重要的作用。

海洋的面积约占地球总表面积的3/4，在海洋高盐、高压、低温、低营养或无光照等特殊的生态环境下，造就了海洋沉积物中微生物的多样性，是海洋环境下生物多样性的主要来源之一。

沉积物是集化学物质和微生物于一体的特殊生态环境[1]，海洋沉积物中的微生物往往因适应其特殊环境而引起功能、遗传、系统发育的多样性，是海洋沉积物微生物分子生态学研究中重要的一部分。

目前自然环境中可培养的微生物可能不及所有微生物总数的1%[2]，可知约占99%的微生物至今难以培养，甚至一些微生物处于“存活却无法培养”的状态，可见海洋微生物及其沉淀物中的微生物拥有巨大的开发利用价值。

宏基因组学(或元基因组学，Metagenomics)是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，不依赖于有机体培养的技术手段。

研究流程一般包括从环境样品中提取基因组DNA，再进行高通量测序分析或克隆DNA到合适的载体中，再载导入宿主菌体，筛选出目的转化子等现代分子生物学工作。

与传统纯培养方法相比较而言，传统方法是对微生物先进行纯培养，再进行重复筛选的过程，因此筛选出的新活性物质的几率是不断降低的[3]。

而基于宏基因组学的现代分子生物学研究中不需要先对微生物进行人工培养，可以直接从特定的环境中提取出微生物的总DNA，再进行基因的测序等操作，从而开发微生物和基因资源。

宏基因组学的出现使人们打破了物种界的界限，突破了传统方法的局限，为微生物新资源的开发利用提供了更好的技术平台[4]。

随着现代分子生物学研究技术的不断发展，宏基因组学在微生物学的研究中得到广泛的应用。

在农业微生物研究方面，可以用于改造土壤、提供有机肥料和改进粮食品种等领域；在医学研究领域中，可以用来研究人或动物体内的微生物群体，如Breitbart等[5]利用宏基因组方法获得了人类粪便中的1200个病毒基因型，在对抗病毒基因研究表达等方面获得了突破性的进展[6]；尤其是在水体环境中新型酶及新型功能的已知酶的宏基因组学研究中具有广泛的应用[7]。

海底沉积物中达50%~80%的物质为腐殖质，腐殖质与DNA在分子大小和理化性质方面比较相近，其化学结构复杂，能够阻碍DNA的提取、分离以及抑制某些活性物质。

因此在进行海洋沉积物中微生物多样性研究中需去除腐殖质对DNA提取质量的影响。

同时能否获得高质量、高纯度的DNA对后面的微生物学分析和下游生物学实验起着决定性的作用。

从程凡升等[7]在水体宏基因组学研究进展及应用中可知以水中微生物为研究对象的宏基因组构建比较容易，而对于海洋沉积物环境下的以底泥及附着微生物为研究对象的宏基因组的构建却困难很多，存在泥微粒对于DNA的附着及其酚类物质对DNA及后续操作污染等问题。

可见DNA的提取存在一些难题，从另一方面证明提取出高质量的DNA对于海洋沉积物海洋沉积物总DNA提取方法研究进展微生物的研究起着关键性影响。

Lesack等[8]在16S rDNA基因克隆的研究中发现，DNA提取的基因片段及质量效果不好时可能会导致2种不同的16S rDNA类型的结果出现。

即验证了DNA的提取过程是宏基因组学研究的关键与前提。

刘璞等[1]在海洋沉积物微生物多样性研究中进行了存在问题的总结概述，结果如表1。

在海洋沉积物微生物研究中DNA的提取是研究现代分子生物学的基础，获得完整性好、纯度高和品质好的DNA是宏基因组学的必需条件。

而在DNA提取的过程中由于材料来源、微生物多样性及环境组成成分是不同的，因此提取方法往往存在一定的差异。

张宁等[9]在对动物、植物、微生物以及海洋生物DNA提取进展的比较中发现：不同来源实验材料由于其组织和细胞结构特点不同往往采用不同的DNA 提取方法。

其中对于海洋沉积物微生物的研究虽然方法较多，但技术方法尚不完善，仍然存在微生物DNA 流失等一些问题，可见对于海洋沉积物微生物总DNA的提取方法探究方面仍然有很大的发展空间，因此本研究对海洋沉积物微生物总DNA提取方法方面进行系统的分类概述，并针对其中存在的一些问题优化出最佳方案。

2. 样品取样、运输、保存海洋沉积物是一种特殊的生态环境，其来源复杂多样。

通常采取表层样品，并且要求重金属类样品装在聚乙烯塑料袋中，油类样品放在广口磨砂玻璃瓶中。

因此一般借助采样器进行采样。

表层样品可用咬合采泥器直接取样，如果底质为基岩或砾石时，可使用拖网采样法进行采样[10]。

参照《海洋生态环境监测技术规程》，采集后立即4℃下冷藏运输到实验室，在无菌室中的超净台上取出柱状样品，去除样品外表层以防陆地空气等其他污染，按2 cm进行分层，再分别放入无菌塑料盒中于−40℃保存备用[11]。

3. 样品的预处理样品的预处理主要包括直接法和间接法。

直接法用来去除样品中腐殖酸、蛋白质等杂质的干扰；间接法主要提取样品中的细胞悬液。

目前普遍使用的是间接法[12]，即通过梯度离心、离心洗涤等操作方式来去除样品中的腐殖酸、蛋白质等杂质的影响，这样收集和裂解的细胞就可以减少或者避免杂质对实验的影响，其不足是容易造成微生物种类和数量的丢失[13]。

在对海洋沉积物中微生物总DNA提取过程中，可能还会受到胞外游离的DNA、无机物和有机物的干扰。

Nathalie等[14]建议在裂解细胞前，采用磷酸缓冲液进行样品的处理；张娇等[15]在研究DNA提取方法对菌的多样性中采用了此法，获得了较好的纯化结果。

在DNA提取的杂质去除过程中，王琦等[16]在海水多营养层次生态养殖池塘细菌群落分析及与环境因子中比较了三种DNA提取方法，采用CTAB和蛋白酶K，与蛋白质和多聚糖形成复合物，再通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质，提取结果表明提取的DNA产量最高并无明显拖尾，说明杂质去除效果明显；而王宇等[17]通过改进的Tiedje [18]法采用同样方法去除杂质的影响。

提取结果发现：Table 1. Problems are classified study microbial diversity in marine sediments [1]表1.海洋沉积物微生物多样性研究中存在问题归类[1]项目存在问题核酸回收无法回收全部的DNA或RNA；菌体细胞无法完全裂解并且重复性差；伴有腐殖质等杂质的干扰。