酶法制备大米活性肽及抗氧化性的研究
摘要以水解液中活性多肽的得率为目标,分别采用5种蛋白酶对大米蛋白进行水解,得出最佳水解酶。
水解大米蛋白然后脱盐处理,用铁氰化钾测定了大米多肽的还原能力,并考查了大米多肽对羟基自由基(·OH)、超氧阴离子(O2-·)、二苯代苦味肼酰基自由基(DPPH·)的抑制作用,并同VC做了比较。
结果表明:大米蛋白制备活性肽的最佳水解工具酶为枯草杆菌碱性蛋白酶。
大米多肽具有还原能力,并对这几种自由基体系具有不同的清除作用。
在20.00～50.00 mg/mL时,大米多肽和VC对·OH的清除作用相当;大米多肽对O2-·的清除作用随浓度的增加而增强;在 5.00 mg/mL时,大米多肽对DPPH·的清除率达到57.69%,但对O2-·和DPPH·的清除能力均低于VC。
关键词大米多肽;碱性蛋白酶;抗氧化
StudyontheEnzymaticPreparationofRiceAntioxidantPeptides
SHEN Yan-haoLIU Fang*
(College of Food Science and Engineering,Central South University of Forestry and Technology,Changsha Hunan 410004)
AbstractRice protein were hydrolyzed by five protease respectively,with the indexes of yield and reducing power of peptides in hydrolyzate. The results showed that the optimum enzyme was Bacillus subitilis alkali protease. The deoxidizing capability of rice peptide was evaluated by using K3(Fe(CN)6)test.The antioxidant activity of rice peptide was studied through the systems of hydroxyl radical(·OH),superoxide radical(O2-·)andDPPH·,compared with those of VC.The results show that the rice peptide had different scavenging effects on these radical systems. At a concentration of 20.00～50.00 mg/mL,the scavenging capability of the rice peptide for hydroxyl radical was similar to that of VC,but for DPPH·and O2-·were lower than those of VC. The scavenging effect of rice peptide to O2-· has increased with the increase of concentration. At 5.00 mg/mL,the scavenging rate of the rice peptide for DPPH·was 57.69%.
Key wordsrice peptides;alkali protease;antioxidation
我国是稻谷生产大国,年产稻谷1.8亿t以上,具有丰富的大米蛋白资源。
大米中赖氨酸含量高,并具有良好的氨基酸组成配比,消化率高,营养价值高[1],是一种优良的植物蛋白。
近年来,人们研究发现,一些蛋白质在水解后产生的肽类具有比
其本身更强的生理活性。
目前,大米蛋白酶解制备的活性肽,国外研究比较多,并已经应用到各种食品中,而我国只是初具端倪,还有待发展[2]。
对大米抗氧化肽活性肽研究,还只停留在实验室阶段,虽已经证实其抗氧化性,但是到规模化的生产还有距离。
由于大米蛋白的低过敏性的优点,它已经受到研究者的关注。
人体自由基应处于平衡中,如果自由基过多或者清除过少,就会对组织产生伤害[3]。
因此,寻找高效、低毒抗氧化剂也一直是研究者的目标。
本试验通过5种酶水解大米蛋白,确定最佳水解酶,并用多种化学模型,对大米多肽的抗氧化活性进行了研究。
1材料与方法
1.1试验材料
供试大米蛋白购于湖南长沙昕晟食品有限责任公司。
试剂为:标准多肽(Sigma公司);枯草杆菌碱性蛋白酶(以下简称碱性蛋白酶),米曲霉中性蛋白酶(以下简称中性蛋白酶),米曲霉酸性蛋白酶(以下简称酸性蛋白酶)(北京东华强盛生物技术有限公司);复合酶(实验室自行配制);胰蛋白酶(国药集团化学试剂有限公司);二苯代苦味肼酰基自由(Sigma公司);大孔树脂DA201-C(安徽三星树脂科技有限公司);维生素C(山西云鹏制药有限公司);其他所有试剂均为国产分析纯。
主要仪器为:电热恒温水浴锅(DSY-2-8)(浙江余姚工业仪表三厂);台式离心机(TDL-5)(上海安亭科学仪器厂);酸度计(pHS-3C)(上海虹益仪器仪表有限公司);真空冷冻干燥机(广东韶关科力实验仪器有限公司);可见分光光度计(722S)(上海精密科学仪器有限公司)。
1.2 试验方法
1.2.1大米多肽的制备。
大米蛋白悬浮液→调节pH值→按各种酶最适条件进行酶解→85 ℃、10 min灭酶→4 000 r/min离心→大米活性肽粗提液→上清液旋转蒸发、冷冻干燥→大米多肽粗品。
各类酶的水解条件分别为:碱性蛋白酶pH值9.0,55 ℃;中性蛋白酶pH值7.0,40 ℃;酸性蛋白酶pH值3.5,40 ℃;胰蛋白酶pH 值8.0,25 ℃;复合蛋白酶碱性蛋白酶pH值9.0、中性蛋白酶pH值7.0,42 ℃,酶用量均为60 U/mL。
1.2.2多肽标准曲线的绘制。
取10个10 mL的容量瓶,用5%的TCA依次配制0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液,然后分别取6.0 mL标准溶液,加入4.0 mL双缩脲试剂,于漩涡混合仪上混合均匀,静置10 min,2 000 r/min离心10 min,取上层清液,用1 cm光径比色皿,于540 nm下测定OD值(以第1管作空白对照)。
以肽的浓度为横坐标x(mg/mL),OD值为纵坐标y,制作标准曲线(图1)。
1.2.3酶解液中活性肽含量的测定。
取2.5 mL酶解液,加入2.5 mL 10%的三氯乙酸(TCA)水溶液,于漩涡混合仪上混合均匀,静置10min,然后在4 000r/min下离心15 min,将上清液全部转移到50 mL容量瓶中,并用5%的TCA定容至刻度,摇匀。
然后取6.0 mL上述溶液置另一试管中,加入双缩脲试剂4.9 mL(样液∶双缩脲试剂=3∶2,V/V),于漩涡混合仪上混合均匀,静置30 min显色,取上清液540 nm
下测定OD值,对照标准曲线的样品溶液中的多肽浓度C(mg/mL),进而可求得样品中多肽含量。