但对真菌菌丝和藻类更合适。 ► 有效能量利用率很低。 ► 设计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能 力。 ► 影响破碎率的操作参数较多，过程优化设计 较复杂。
39
撞击破碎
破碎原理
细胞冷冻后成为易于破碎的刚性球体， 高速载气（高速氮气流，约300m/s） 使细胞高速撞击固定的撞击板而破碎。
40
撞击破碎
14
高价无机离子的去除方法
1.Ca2+ ——草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀； 2.Mg2+——三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁可 溶性络合物； 3.Fe2+ ——黄血盐，→普鲁士兰沉淀
15
第二节 细胞破碎 （Cell disruption）
生物分离过程的一般流程
原料液 原料液 固液分离 离心，过滤 ) ( 细胞分离 离心，过滤 ( ) 细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 溶解( 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离 粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳) 层析、电泳 ) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩(超过滤) 浓缩( 超过滤) 精制( 结晶、干燥) 结晶、干燥 )
53
常用酶
细胞壁溶解酶 β-1，6-葡聚糖酶 甘露糖酶
5
预处理目的
► 促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固
液分离的效率。
改变原料液的物理性质，包括增大悬浮液中固体 粒子的尺寸，降低液体黏度； 将产物转入便于后处理的相中（多数为液相）； 除去部分杂质。
6
预处理方法
1、加热法
将原料液加热到目标产物稳定的温度范围内。 能够降低黏度、促凝聚、部分杂蛋白变性沉淀；
3
路线一
路线二
清液－胞外产物
路线一A
预处理（Pretreatment ）
采用凝聚和絮凝等各种方法来加速固相、
液相分离，提高过滤或离心速度。
4
为何要对料液进行预处理？
► 料液的基本特性
料液的成分很复杂，目标物质浓度较低，大多为 1-10%； 悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似； 可压缩性； 液相粘度大，大多为非牛顿型流体； 悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动。
23
破碎效率的评价
►
破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百 分数。
Y% =
►
(N 0 - N )
N0
*100%
细胞数量的确定
直接计数法：血球板计数 间接计数：测定破碎后悬浮液中蛋白质或酶等的含 量
24
高压匀浆 （High-pressure homogenization）
破碎原理
利用高压使细胞悬液从阀座与阀之间的环 隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受 到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境， 从而在撞击力和剪切力等综合作用下破裂。
表面活性剂
49
化学破碎法
► 优点
对产物的释放具有一定的选择性； 细胞保持完整，碎片少，料液粘度低，易于固液 分离。
► 缺点
通用性差，某种试剂只能作用于特定类型的细胞； 时间长，效率低，产物释放率低； 有些化学试剂有毒。
50
酶溶法（Enzymatic lysis）
破碎原理
利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，部分或 完全破坏细胞壁，增大胞内产物的通透性。
1、四环素类抗生素由 于能和Ca2+、Mg2+离子 等形成不溶解的化合物， 大部分沉积在菌丝体内， 用草酸酸化后，抗生素 转入水相。
2、链霉素在中性发酵 液中，约有25%在菌丝 内，当酸化后就能逐步 释放出来。
8
预处理方法
3、凝聚
在凝聚剂作用下, 胶体去稳定，并聚集成1mm大 小的凝聚块的过程。
机理：
51
酶溶法
► 自溶（autolysis）
诱使细胞产生溶解自身的酶的特殊酶溶法。 如酵母在45－50℃下保温20小时，可发生自溶。 乳糖发酵短杆菌发酵生产谷氨酸，利用pH10的缓 冲液配成3%的悬浮液，加热到70℃，保温搅拌 20min，发生自溶。
52
常用酶
溶菌酶 （Lysozyme）
用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解， 用于革兰氏阴性菌时，需添加EDTA。
不同微生物细胞壁比较
微生物
壁厚 （nm） 层次
革兰氏阳 性菌
20－80
革兰氏阴 性菌
10－13
酵母菌
100－300
霉菌
100－250
单层
肽聚糖 （40－90％） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖
多层
肽聚糖 （5－10％） 蛋白质 脂蛋白 脂多糖 磷脂
多层
葡聚糖 （30－40％） 甘露聚糖 （30％） 蛋白质 脂类
► 很强烈的破碎方法； ► 适用多数细胞的破碎； ► 能量利用率极低，操作过程产生大量的热； ► 多在实验室使用。
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化学破碎法
破 碎 原 理
用酸、碱、表面活性剂、有机溶剂 或变性剂等处理细胞， 增大细胞壁或细胞膜的通透性， 或者降低胞内物质间相互作用， 使目标产物易于释放。
48
化学破碎法
酸碱 化学 破碎 有机溶剂 变性剂
第二章
料液预处理与细胞破碎
第一节 料液预处理 第二节 细胞破碎 第三节 蛋白质的复性
分离工艺实例
1
第一节 料液预处理
生物分离过程的一般流程
原料液 原料液 固液分离 离心，过滤 ) ( 细胞分离 离心，过滤 ( ) 细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 溶解( 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离 粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳) 层析、电泳 ) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩(超过滤) 浓缩( 超过滤) 精制( 结晶、干燥) 结晶、干燥 )
31
高压匀浆的特点
► 适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎；
► 不宜用于团状或丝状真菌及较小的革兰氏
阳性菌的破碎； ► 质地坚硬的亚细胞器（如包涵体），易损 伤阀座，不适宜该法处理； ► 由于操作中温度会升高，需对料液作冷却 处理，保护目的产物活性。
32
高速珠磨法
（High-speed bead mill）
多层
多聚糖 （80－90％） 脂类 20 蛋白质
主要组成
细胞的结构
► 不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易
程度也不同，由难到易的大致排列顺序为： 植物细胞＞真菌（如酵母菌）＞革兰氏阳性 细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。
► 破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到
不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产 物。
35
Netzsch LM-20型珠磨机

园盘以两种位臵交错地安装在轴上， 一种处于径向，一种与轴倾斜， 径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。 由于交错的运动，提高了破碎效率。
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高速珠磨法
► 破碎作用符合一级反应动力学，破碎程度常
用细胞破碎率（％）或单位细胞释放出的内 含物（mg/g）来表示。现采用破碎率表示， 其动力学方程为： 间歇操作： 连续操作：
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常见的胞内产品
产物 生产菌 用途 治疗急性淋巴 Escherichia coli 癌
L－天冬酰胺酶
过氧化氢酶 β-半乳糖苷酶 α-干扰素 胰岛素
Aspergillus niger Saccharomyces lactis Escherichia coli Escherichia coli
脱除H2O2 水解乳糖 治疗白血病 治疗糖尿病19
21
细胞破碎法
细胞 破碎法 机械法 非机械法
Байду номын сангаас
珠磨法 匀浆法 超声法
物理法
冻融法 渗透压法
化学法
有机溶 剂法 表面活 性剂法
生物法
酶法
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细胞破碎原理
► 机械法破碎
细胞在机械作用力下受到压缩和剪切而破碎。 细胞越小，所需压缩或剪切力越大，越难破 碎。
► 非机械法破碎
利用化学试剂、生化试剂（酶）或物理性质 改变细胞壁或细胞膜结构，增大胞内物质的 溶出速率；或者完全溶解细胞壁，形成原生 质体后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释 放胞内物质。
1）中和粒子表面电荷 2）消除双电层结构 3）破坏水化膜
常用凝聚剂： A、无机盐类， 如硫酸铝、明矾等； B、无机碱，如 Al(OH)3、Fe(OH)3等。
9
预处理方法
4、絮凝
使用絮凝剂将胶体颗粒交连成网，形成10 mm 大小的絮凝团过程。
机理：架桥作用。
10
絮凝剂
►
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分 子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其 链节上含有许多活性官能团，包括离子基团以及非 离子型基团。
25
高压匀浆
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标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀 锥型阀 球型细胞破碎阀 高压匀浆器各种阀型设计
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高压匀浆器的种类
► 高压匀浆器的种类较多：
WAB公司的AVP Gaulin 31MR型 Bran and luebbe 公司SHL40型 意大利Niro Soavi
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意大利Niro Soavi-NS1001L型实验室级 高压匀浆器 高压匀浆机
29
高压匀浆
破碎动力学方程：
1 α ln kNp (1 S)
其中：
R S Rm
S－破碎率 k－速率常数 N－循环次数 p－操作压力
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主要影响因素
细胞种类
影响k值
操作压力p 影响 因素
p, R ;相反, R 。 温度 2C /10MPa。