耐盐乳酸菌的筛选和鉴定
摘要：本实验从酱油厂提供的酱油原醅中分离筛选出耐盐乳酸菌，该菌在18%以上NaCl 浓度的条件下能够正常生长代谢，初步鉴定其为四联球菌属，可用于高盐稀醪酱油酿造目前国内尚无耐盐度达18%的乳酸菌种, 该菌种的成功选育为国内首创。
关键词乳酸菌耐盐筛选鉴定
酱油采用高盐稀醪发酵工艺生产时能有更好的质量和香味。
其工艺上需要在酱醅发酵过程中添加酵母菌和乳酸菌。
然而酱油的含盐度高达18%，这就需要选育出耐盐菌种。
关于耐盐酵母的应用报道已有很多。
而乳酸菌方面，目前在国内菌种库内尚无耐盐度达18%的菌种。
我们作为酱油大国，筛选出耐盐度达18%的嗜盐乳酸菌的意义则显得十分重大。
本实验主要对高盐稀态发酵工艺酱醅中嗜盐乳酸菌进行分离筛选及鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
酱醅、草酸铵结晶紫液（革兰氏A液）、路哥尔氏碘液（革兰氏B液）、蕃红花红（沙黄）、生理盐水。
1.2 实验方法
1.2.1 分离筛选流程(如图1)
1.2.2 筛选方法
十倍稀释法、平板涂布法、斜面之字划线法、平板四分法划线。
1.2.3 鉴定方法
1.2.3.1 革兰氏染色法
1.2.3.2 过氧化氢酶接触酶测定
取一环琼脂斜面的培养物，涂于干净载玻片上，然后加1 滴3% -15% H2O2，若有气泡产生则为阳性反应，无气泡为阴性反应。
或将3%-15% H2O2加到斜面的菌苔上观察是否有气泡的产生。
1.2.3.3 生化鉴定管使用方法
挑取待检菌革兰氏染色镜检，将新鲜菌苔接种于普通肉汤中，37摄氏度培养18-24h。
各吸取0.05-0.08ml（约1-2滴）的肉汤培养物或菌悬液加入每种微量生化管内，将已接种生化管套上无菌塑料帽直立于三折吸塑短架内，于35-37摄氏度培养箱中培养。
1.2.3.4 高效液相色谱HPLC 测量乳酸含量(图2)
2 结果与讨论
2.1 耐盐乳酸菌的筛选
2.1.1 富集培养分离初筛(如图3)
耐盐度能达10%以上的乳酸菌基本都在片球菌属和四联球菌属这
二个属内。
而四联球菌的耐盐度更高达18%以上，所以我们分离筛选的目标在四联球菌上。
四联球菌的菌落为乳白色，成小圆点状。
显微镜下观察，菌体四联或成对，极少成单。
这便是我们初筛时的重要依据。
用富集培养基取代分离培养基对酱油曲进行培养在这样的条件下培养。
两天后平板上出现的菌落有不少类似于乳酸菌。
将镜检为球菌的菌落挑出，进行液体培养。
然后从中筛选出具有四联形态的菌种。
2.1.2 菌种的纯化（复筛）
将初筛菌种在含15%NaCl浓度的液体培养基中培养在培养过程中
定期镜检，观察菌种的生长状况。
生长4天后,进行平板涂布、之字形划线以及平板四分法划线分离。
然后从经培养后的平板和斜面上挑出镜检为四联球菌特征的菌落继
续培养。
如此反复，直到确定其为单一菌株为止。
最后在OLYMPUS BX51 型正置照相显微镜下的观察。
对菌种进行保藏。
2.2 耐盐乳酸菌的鉴定
2.2.1 菌落形态
待鉴定菌的菌落形态，成乳白色，油脂状。
在30摄氏度pH约7.0
的液体培养基和琼脂平板或斜面上均能正常生长。
2.2.2 革兰氏染色和过氧化氢酶测定
对所筛菌种做革兰氏染色，成阳性反应。
利用电子显微镜对菌种
拍照如图9。
2.2.3 pH 值对待鉴定菌种生长的影响
在片球菌与气球菌的鉴别上，pH值是一个重要的区分因素。
片球菌在pH5下能生长，而气球菌则不能；在pH9.0的情况则正好相反。
本实验分别做了液体培养基初始 pH=4.5和9.0下的生长情况记录。
乳酸菌在其生长过程中会产生乳酸、醋酸等有机酸，从而降低培养基的pH值。
而当pH值降低到一定程度后，又会反过来抑制乳酸菌的生长。
从表2 可看到在培养基初始pH=4.5的情况下，该菌种还能生长，但从第二天开始，生长则变得比较缓慢。
所以，可得出结论：待鉴定菌是可以在pH =5.0下生长的。
由于没能找到能有效维持液体培养基 pH值在9.0的缓冲溶液，所以，即使初始pH为9.0，但伴随着极少数乳酸菌的生长代谢，溶液pH 值也将不断下降，从而使其逐渐变得适合该菌生长。
所以初始pH =9.0的这组生长记录数据不能取用。
但我们可以从表中看到从第四天到第六天，OD600 值有很大的提高。
验证了前面培养基会逐渐变得适合菌种生长的推断。
基于以上数据我们判断待鉴定菌为片球菌属。
3 结论
3.1 酪蛋白水解物具有明显促进酸奶发酵的作用。
随水解物添加量增加，促进发酵程度提高1.5%-2.0%添加量的水解物对酸奶的促发酵效果接近。
3.2 添加酪蛋白水解物改变了酸奶发酵过程中的pH下降：速度添加样在发酵前4h的pH下降速度高于空白样，而发酵4h后空白样的pH 降速度略快；发酵中期，二者的pH下降速度存在最大差距。
3.3 不同水解程度的酪蛋白水解物，在对酸奶的促发酵程度上，表现出随水解程度增加，促发酵程度提高除2h水解物的促发酵程度较小外，8h ，12h，和24h三种水解物的促发酵能力基本相当（三者的凝
乳时间，产酸速度发酵时间都接近）。
3.4 二者的质构比较表明添加2%酪蛋白水解物对酸奶的质构有所改善，赋予酸奶更丰厚的口感，改善酸质地并提高稳定性。