z 缓冲液F： 8 M Urea，100 mM NaH2PO4，100
mM Tris·Cl，用高浓度HCl调节pH至6.3。 z 缓冲液G： 8 M Urea，100 mM NaH2PO4，100
mM Tris·Cl，用高浓度HCl调节pH至4.5。 各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45 μm滤膜过滤备用。 注：也可按照可溶性蛋白的缓冲液配制与操作方式 进行，只需在缓冲液中加入8M脲或6M盐酸胍。
让介质自然沉降。
3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平
面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片
与介质接触面滞留气泡（如对实验要求并非十
分严格，为提高流速，可不覆盖上垫片）。
4) 在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可
先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒
出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所
层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。
3) 从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降
平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转
换杆与介质接触面间滞留气泡。
4) 在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下
上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中
滤网，清洗或更换后重新装柱。
4. 过柱：
1) 用5~10倍介质体积的缓冲液A平衡亲和柱；
六、 实验实例
1. Ni-NTA Agarose 纯化 His-tag 蛋白 z 层析介质：纯泰®NTA 1ml；对照介质（国际领
先品牌）1ml z 样品：表达可溶性 His-tag 融合 thioredoxin 的
大肠杆菌 BL21 裂解液 z 结合缓冲液：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，
3. 操作步骤：
1.低分子量 Marker； 2.上样液； 3.纯泰®NTA-流穿液； 4.纯泰®NTA-洗脱液； 5.对照-流穿液； 6.对照-洗脱液
2. Ni-IDA Agarose 纯化 His-tag 蛋白 z 层析介质：纯泰®IDA 1ml；纯泰®NTA 1ml z 样品：表达 His-tag 融合 thioredoxin 的大肠杆
按每克湿重菌体/4~5ml缓冲液A的比例充分悬
-1-
浮离心收集的菌体，400w功率下，每个循环超声3s， 冷却2s，共循环180次破碎菌体；4℃、13000rpm离 心15m，收集上清液或用0.45μm滤膜过滤，并用高 浓度NaOH调节 pH至8.0待上样。
3. 装柱：
z 聚苯乙烯层析柱
1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析
1ml，0.5ml/min 123456
1) 用10倍介质体积缓冲液E平衡亲和柱； 2) 上样；
3) 用10倍介质体积缓冲液E过柱，重新平衡介质；
4) 用10倍柱体积缓冲液F过柱，洗去未结合的杂 蛋白；
5) 用5~10倍柱体积缓冲液G洗脱，收集洗脱液。
6) 用10倍柱体积缓冲液A重新平衡介质。
_____注__：___纯__化__过___程__流__速___不__宜___过__快__，___对__于__1__m_l_介__质___，__流__ 速
二、 性能参数
特点
基质 配体 配体密度 吸附载量 介质平均粒径 最大流速
pH范围
保存温度 保存液体
特殊NTA、IDA结构设计，蛋白载 量大，专一性高，使用寿命长
6%的交联琼脂糖凝胶
NTA-Ni2+/
2+
IDA-Ni
20~40μmol /ml ≥30mg蛋白(60kda)/ml
100μm
600cm/h 3~10，在位清洗时pH范围可到
6. 介质保存
4℃~8℃条件下，介质可长期保存于20%乙醇 中。
7. SDS-PAGE检测：
1) 不同浓度SDS-PAGE分离胶分离范围
-2-
分离胶浓度 6% 8% 10% 12% 15%
分离范围 50～150kD 30～90kD 20～80kD 12～60kD 10～40kD
2) SDS-PAGE操作流程
纯泰特殊结构设计的镍离子金属螯合亲和层 析介质包括Ni-NTA和Ni-IDA两种配体，既具有特 异性好、螯合镍更稳定，镍离子脱落少，使用寿命 长的优势，同时具有基础层析介质颗粒粒度均匀， 流速快的优点，并且物理和化学稳定性好，能耐受 更高浓度的还原剂、变性剂和去垢剂，批次重复性 好，质量稳定。本产品已经螯合好镍离子，使用更 方便。 注：镍离子有六个螯合价位，Ni-NTA螯合了四价， 剩余两价；而Ni-IDA螯合三价，剩余三价。因此 Ni-IDA Agarose结合作用力要比Ni-NTA Agarose 强 ， 在 同 样 条 件 下 Ni-IDA Agarose 的 载 量 要 比 Ni-NTA Agarose高，而且洗脱杂质和目标蛋白所用 的缓冲液中咪唑浓度更高；但Ni-NTA Agarose更稳 定，耐受更强的还原剂，镍离子更不易脱落。具体 应用何种介质视个人习惯以及纯化条件而定。
镍离子金属螯合亲和层析介质使用说明书（完全版）
一、 简介
三、 适用范围
金属螯合亲和层析，又称固定金属离子亲和色 谱，其纯化原理是利用蛋白质表面的组氨酸与多种 过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+形成 配位相互作用，从而能够吸附富含这类氨基酸的蛋 白质，从而达到分离纯化的目的。因此，固定有这 些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地纯化这 类含有多个组氨酸的蛋白以及多肽和核苷酸。半胱 氨酸和色氨酸与固定金属离子结合力要远小于组 氨酸残基，对纯化影响不大。
2) 上样；
3) 用5~10倍介质体积缓冲液A洗去层析柱中未结
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2~11 +4~8℃ 20%乙醇
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分离His融合蛋白及能被金属离子吸附的多肽、 蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。
四、 E.coli表达可溶性his重组蛋白纯化操作说明
1. 缓冲液配制 z 缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，
1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl， 用高浓度NaOHl调节pH值至8.0。 z 缓冲液B（洗脱缓冲液）：50mM NaH2PO4， 300mM NaCl，500mM imidazole（咪唑），用 高浓度NaOHl调节pH值至8.0。 z 缓冲液C（咪唑浓度稀释液）：50mM NaH2PO4， 300mM NaCl，用高浓度NaOH调节pH值至8.0。 注：如使用试剂盒，盒中提供10×缓冲液A、1×缓冲 液B和10×缓冲液C的配制干粉。分别在缓冲液A和C 的盛装容器中加入双蒸水定容至100ml，得到缓冲 液A和C的10倍浓缩液，使用时根据需要取一定量进 行10倍稀释，即得到上述正常使用浓度的两种溶 液。缓冲液B的每包配制干粉可配制1×缓冲液B 500ml，配制时将一包干粉先溶于适量双蒸水中， 最后定容至500ml。每种缓冲液均应在稀释成正常 使用浓度以后，再调节pH值。 z 缓冲液D（咪唑梯度洗脱液）：用缓冲液B和缓 冲液C按不同比例配制，配制比例如下（100ml 总体积）：
140mM NaCl，2.7mM KCl，pH 8.0 z 洗脱缓冲液：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，
250mM imidazole，pH 8.0 z 流速：纯泰®NTA 1ml，0.5ml/min；对照介质
1ml，0.5ml/min
1. 缓冲液配制：
12 3 4 5 6
z 缓冲液E： 8 M Urea，100 mM NaH2PO4，100 mM Tris·Cl，用高浓度NaOH调节pH至8.0。
2. 样品处理：
1) 冰上融化冻存菌体，待其完全融化后按每克湿 重菌体/5ml缓冲液E的比例充分悬浮菌体。
2) 室温条件下振摇菌体15～60min，通过温和涡旋 振荡或超声处理裂解菌体，注意避免产生泡沫。 溶液变得透明表明裂解完全。
3) 4℃、13000rpm离心15min，收集上清液或用 0.45μm滤膜过滤，并用高浓度NaOH调节 pH至 8.0待上样。
网址：
合蛋白； 4) 用缓冲液B和缓冲液C配制的不同浓度缓冲液D
洗脱； 9 最高纯度洗脱方案：用含0、60、100、150、
200、250mM 咪唑的缓冲液D分步洗脱，每 个梯度2~3倍介质体积洗脱； 9 最高收率洗脱方案：先用5~10倍介质体积 含20mM咪唑的缓冲液D洗脱，再用5~10倍 介质体积含250mM咪唑的缓冲液D洗脱。 注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速 保持在0.5ml/min为宜。 5. 介质清洗与再生： 如果使用一段时间以后，介质上有杂质沉积导 致介质颜色改变和蛋白结合能力下降，需对介质进 行清洗或再生。 z 介质清洗： 1) 用10倍介质体积0.5M NaOH过柱，适当调整流 速，或洗脱至10倍介质体积时停30min后继续洗 脱，保证介质与NaOH溶液接触时间达到30min 以上。 2) 用10倍介质体积去离子水洗去层析柱中的碱 液。 3) 用10倍介质体积缓冲液A平衡层析柱。 z 介质再生： 1) 用2~5倍介质体积脱镍缓冲液（50mM Na3PO4， 300mM NaCl，100mM EDTA，pH 8.0）过柱； 2) 用5-10倍介质体积0.5M NaOH过柱，适当调整 流速，如流速较快，则洗脱至10倍介质体积时 停30min后继续洗脱，保证介质与NaOH溶液接 触时间达到30min以上； 3) 用10倍介质体积去离子水洗柱； 4) 用3倍介质体积10mM Na3PO4，1M NaCl，pH 7.4 缓冲液平衡层析柱； 5) 用3倍介质体积20mM NiCl2或NiSO4 (溶于去离 子水)过柱； 6) 用3倍介质体积10mM Na3PO4，1M NaCl，pH 7.4 缓冲液洗柱； 7) 用5倍介质体积缓冲液A平衡层析柱。