异配体通过适当的化学反应共价地连接 到象琼脂糖一类的载体表面的功能基团 上，然后将待纯化的蛋白质溶液过柱 （即柱层析）,从而分离出要纯化的目的 蛋白.
关于亲合层析….

分类：凝集素亲合层析、免疫层析、金
属鏊合层析等

应 用：分离核苷酸、核酸、免疫球蛋白、
膜受体、细胞器等；对于酶蛋白，配体可 以是底物、可逆抑制剂、别构效应物等

透析原理、目的？如何操作？
SDS-PAGE 原理与用途？如何操作？ 蛋白操作应注意哪些事项？ 如何检测酶活？ 蛋白浓缩有哪些方法？
第二部分
电泳技术
电泳技术
琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophoresis ） 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE ) 等电聚焦电泳(IFE: isoelectric focusing ) 双向电泳( 2-DE: two –dimensional electrophoresis ) 毛细管电泳(CE: capillary electrophoresis )
不同浓度分离胶分离蛋白质范围：
15% 12.5% 10% 7.5% 5% 15-45Kd 15-60Kd 18-75Kd 30-120Kd 60-210Kd
思考题
为什么要在样品中加少许溴酚兰和一定浓度的

蔗糖溶液？蔗糖及溴酚兰的作用分别是什么？
配体 固定相
亲和层析过程
偶联
溶液
杂质
金属螯合层析法
固定相
亲和层析的基本特点

纯化过程简单、迅速，且分离效率高 特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物 大分子 纯化倍数大，产物纯度高


必须针对某一分离对象，制备专一的配基及寻求稳 定的层析条件,因此应用范围受到一定的限制
具有特异性亲和作用的生物分子
(4) 活化的羧基琼脂糖凝胶 4B (Activated CH-sepharose 4B)：含有六 碳连接臂和一个活化的酯化基团，可自发地与含有氨基的配基 偶联。 (5) 环氧活化的琼脂糖凝胶 6B (Epoxy-activated sepharose 6B)：含有 一条长的亲水连接臂，可与含有羟基、氨基或巯基的配基偶联。
生化制备技术理论课程
亲合层析（Affinity chromatography )
概 述：
是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力（即 生物学亲和力），建立起来的一种有效的纯化方法。
它经常需要经过一步处理即可将某种所需蛋白质从 复杂的混合物中分离出来，而且纯度相当高。
关于亲合层析….

基本原理：把待纯化的某一蛋白质的特

抗原与抗体
DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA)
酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体 维生素与其特异性结合蛋白 糖蛋白与其相应的植物凝集素

亲和层析载体的性质与选择

具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由 通过，具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速 具有惰性，尽量减少非专一性吸附 具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共 价合偶联 在偶联、吸附析
在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固 定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析， 达到分离纯化目的。 例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作 为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为
固定相，使样品中的辅酶分离纯化。
一、配基与偶联凝胶的选择与处理
在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基(ligand)。 配基必须偶联于不溶性母体(matrix) (又称载体)上，常用
并且进一步与含有：C＝，—C=C—，—N=N—键的化合物反应。
进行亲和层析之前，首先要根据目的物质 的特性，选择与之配对的分子作为配基，然 后根据配基的大小和所含基团等特性选择适 宜的偶联凝胶，再在一定条件下使配基与偶 联凝胶接合。
例如：欲分离某一辅酶，必须选择与之 配对的酶作为配基，由于酶含有氨基，可 选用活化的羧基琼脂糖凝胶4B (Activated CH Sepharose 4B)作为偶联凝胶。再进行 偶联

鸡蛋清
↓
Spharose 4B
↓
猪胰脏
↓
提取
↓
活化
↓
提取
↓
分离纯化
↓
纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose 4B
↓
胰蛋白酶原粗提液
↓
偶 联
↓
激 活
↓
CHOM-Spharose 4B → ←
↓
胰蛋白酶提取液
亲和层析
↓
酶促动力学 ← 纯胰蛋白酶 → 酶活性测定
↓
酶蛋白含量测定
思考题

凝胶层析、离子交换层析、亲合层析原理、用途？ 三者能否重复使用？如何处理？
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率决 定于它所带的净电荷、分子形状和大小，如果在 聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷
基磺酸钠（SDS）和少量巯基乙醇，则蛋白质的
迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来
的电荷和分子形状无关。
附：十二烷基磺酸钠（SDS）
的载体主要有：
琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 纤维素

当用小分子作为配基时，由于空间位阻不易与载 体偶联，或不易与配对分子载体结合。为此通常 在载体和配基之间接入不同长度的连接臂(space arm)。 偶联时，必须首先使载体活化。即通过某种方法 (如溴化氰法、叠氮法等)为载体引入某一活泼的 基团。
二、亲和层析的操作条件
亲和柱层析装柱方法与凝胶层析相同，层析操作与离子交
换层析相似。但由于亲和层析的对象都是生物分子，为防止 生物大分子变性，常在低温(4℃)下进行。亲和层析柱所用的
平衡缓冲液应与样品缓冲液一致，pH一般在近乎中性的范围
内。上柱时流速应尽可能缓慢。上柱后，用大量平衡缓冲液 洗去杂质，然后用洗脱液洗脱亲和物。洗脱结束后，继续用 洗脱液洗涤，直至无亲和物为止。 最后用平衡缓冲液使亲和层析柱平衡，即可重复使用。暂 时不用时，亲和层析柱应置于4℃低温保存。
亲合层析原理
配体分子
琼脂糖 凝胶珠 被吸附的 蛋白质分子
连接臂 亲合洗脱
洗涤除去
亲 合 层 析 原 理
亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可 逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互 配的。主要的有： 酶和底物 酶与竞争性抑制剂 酶和辅酶 抗原与抗体 DNA和RNA 激素和其受体 DNA与结合蛋白。
(6) 活化的巯基琼脂糖凝胶 4B (Activated Thiolsepharose 4B)：含有一 分子谷胱甘肽作为连接臂，可与含有游离巯基的蛋白质配基可 逆偶联。 (7) 巯丙基琼糖凝胶 6B (Thiopropyl sepharose 6B)：含有一个较短的 亲水连接臂 (2-巯 丙基)，可与含有巯基的蛋白质或其他小分 子配基可逆偶联，也可以与重金属离子、烷基和芳香基反应，



亲和层析配基的性质与选择
亲和层析配基的选择

纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力，但亲和 力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需 的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性 配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配 基与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连， 同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力

活化载体
活化载体(包括带连接臂的)已有商品出售。Pharmacia公司出 产的偶联凝胶(coupling gel)可以很简单地与所需的配基偶联，不 需要特殊的设备和复杂的化学反应。常用的有： (1) 溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B (CNBr-activated sepharose 4B)： 通过自发反应可安全 、简便、快速地与含有伯胺基的配基偶联。 (2) 氨基琼脂糖凝胶4B (AH-sepharose 4B)：含有六碳 (C6) 长 度的连接臂，可与含有羧基的配基偶联。 (3) 羧基琼脂糖凝胶4B (CH-sepharose 4B)：含有六碳 (C6) 长 度的连接臂，可与含有氨基的配基偶联。

SDS是一种阴离子变性剂
能够打破蛋白质分子中
的氢键、疏水相互作用，巯基乙醇能够打开二硫键，因 此两者使蛋白质处于伸展状态，同时掩盖了蛋白质的原 有电荷，使不同的样品带有接近相同的负电荷和接近相 同的分子形状，因此迁移率只与分子量大小有关
浓缩胶:浓缩样品 分离胶:分离样品

垂 直 板 电 泳